毛乌兰叶子中分离出内生真菌的抗菌和抗增殖活性研究外文翻译资料

毛乌兰叶子中分离出内生真菌的抗菌和抗增殖活性研究

Mutiat Ibrahim, Nutan Kaushik, Abimbola Sowemimo, Hemraj Chhipa, Trevor Koekemoer, Maryna van de Venter amp; Olukemi A. Odukoya

摘要：

植物内生真菌具有潜在的生物活性。毛乌兰曾被报道称其内生真菌具有抗氧化，抗炎和抗癌等作用。从叶子中分离出来的内生真菌为总状共头霉属和绿色木霉属，通过ITS-rDNA可测定其DNA序列。利用双重培养法检测四种植物病原真菌对内生真菌的拮抗作用。真菌提取物及其组分（3.91-250 ug/ml）抑制HeLa癌细胞生长的半抑菌浓度（IC₅₀）可被计算出来为43.56 ug/ml。通过内生真菌（测试的浓度为250，500和1000 ug/ml）的食物中毒实验和抗拒食活性对病原真菌和斜纹夜蛾幼虫的影响，得出内生真菌菌株及其溶剂抽提物的最小抑菌浓度（MIC）为1000 ug/ml。这些实验结果说明毛乌兰叶子中分离的内生真菌具有良好的健康益处，并且其对于某些致病菌和HeLa癌细胞株的生长繁殖具有抑制作用。

关键词：

绿色木霉属；总状共头霉属；病原真菌；HeLa癌细胞株；斜纹夜蛾幼虫

引言：

内生真菌是最常见的多样性微生物，其常被认为是植物的共生生物，天然活性产物的绝佳来源。对于某些植物来说，内生真菌可以通过改变昆虫吸取的营养质量或者是释放防御型生物碱类化合物来抵抗有害昆虫。例如长圆茎苔草中分离出来的内生真菌被报道称可以通过控制乌氏天竺鲷来减少荷兰榆树病的传播。很多的药用植物被称为是生产抗菌药物的新型生物活性剂，杀虫剂和抗癌药物。毛乌兰常被西部热带非洲当地的草药医生用于治疗一般的婴儿疼痛，水肿，肺部疾病，阴囊象皮肿等。而毛乌兰的乙醇提取物有抗炎，抗菌，抗溃疡等作用。在本实验的目的是分离和鉴别毛乌兰叶子中的内生真菌，探究其提取物和组分的抑菌，抗增殖和拒食活性。

1. 实验材料与方法：
2. 实验材料的收集：

毛乌兰的新鲜树叶于2013年7月从尼日利亚采集。植株样品被保存在密封的塑料袋中，并于同一天运送回实验室分离其中的内生真菌。

1. 植株表面灭菌及分离纯种真菌菌株：

在收集的8小时之内，用自来水洗净植株样品。叶子用无菌刀片剪成大约1cmtimes;1cm大小。在无菌的条件下，叶杆相继浸没在70%的乙醇溶液中60s，10%的次氯酸钠溶液中5min，70%的乙醇中30s，最后用蒸馏水漂洗5min。样品在层流净化罩中风干后，分别接种在马铃薯葡萄糖培养基和麦芽汁琼脂培养基中（培养基已高温灭菌处理并且额外加入0.01%的链霉素抗生素）。室温下培养3-4天之后，可在样品的边缘处观察到新长出来的真菌菌丝。不同的植株样品长出不同的菌株，被分离出来的单株真菌可转接到马铃薯葡萄糖培养基和麦芽汁琼脂培养基中。重复这个步骤直到可以培养出单个均匀分布的菌落为止。通过乳酚蓝棉染色法（取少许样品，用PVUG处理过后，加热65℃，持续3天）显微观察各个真菌菌丝体的显微形态来初步鉴定。

1. 内生真菌的长时间保存：

将一小块长有纯种真菌的培养基分别转移到装有1ml（体积分数为30%）灭菌甘油溶液和大米培养基的离心管中。大约4天即可观察到两种培养基的表面都长有菌落。甘油浸提液转移到-20℃保存，而大米培养基则转移到冰箱中于4℃保存。

1. 内生真菌菌株的分子鉴定：

试剂：萃取缓冲液的配制[200 mM Tris-HCL(PH 7.5)，25 mM EDTA，250 mM NaCl，0.5 % SDS]；冷的苯酚：氯仿（1:1）；氯仿；冷的异丙醇；70 %冷乙醇；PCR缓冲液[10 mmol/L Tris-HCL，(PH 8.8)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂]；ITS1和ITS4引物分别是：（5rsquo;-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3rsquo;）和(5rsquo;-TCCTCCGCTTAT TGATATG-3rsquo;)；混合的dNTP；标记聚合酶；去核酸酶的水；1-1.5 % 琼脂糖凝胶；TBE缓冲液[324 g Tris base，165 g 硼酸，120 ml 0.5M EDTA (PH 8.0)]

1. 真菌材料：

从毛乌兰的叶子中提取出来的纯种菌株接种于PDB培养基中室温培养5-7天后，收集菌丝体并烘干，约30 - 50 mg加入到离心管中，并在其中加入0.5ml的无菌水，振摇30 s后再离心（2000 rpm，5 min）。弃去上清液，收集沉淀物于 -80℃ 放置24 h。冻干的菌丝体利用小铁珠振摇至粉末状。

1. 真菌菌株的DNA提取：

粉末状的菌丝体转移到装有500 ul的萃取缓冲液的离心管中，振摇5 s，在室温下培养30 min后离心（13000 rpm，1 min）。上清液转移到一个新的离心管，加入等体积的冷苯酚和氯仿。简单振摇过后再次离心（13000 rpm，2 min）。上清液转移到新离心管中，加入300 ul的氯仿再次提取。振摇，重复以上步骤。最后得到的上清液转移到新的离心管中，加入300 ul的冷异丙醇。轻轻晃动之后放置在 -80 ℃ 下培养30 min。培养结束后，再次离心（13000 rpm，5 min），弃上清液，除去其中的核酸。最后得到的沉淀物用70 %的冷乙醇冲洗，风干，悬浮于100 ul的无菌水。最终得到的DNA通过电泳来鉴别。

1. PCR扩增：

真菌的特异性DNA 都可由PCR来进行扩增。体系总体积为25 ul，其中包括2.5 ul的10times;PCR缓冲液，0.5 ul的1 mmol dNTPs，2.5 ul的10 pmol ITS1和ITS4引物，1 ul的40 ng的模板DNA和0.25 ul 5个单位的Taq酶。

PCR扩增的过程是：94 ℃下变性2 min， 1 min内重复35次；引物在57℃下退火，持续1.30 min； 72 ℃下延伸，持续时间2 min；最后延伸在72℃下持续4 min。扩增的DNA在1.0times;TBE缓冲液的1.5 %的琼脂糖凝胶中80 v电泳90 min。使用nBLAST软件在放大序列的基础上与NCBI的数据库进行相识度的识别。相似程度见表一。

致病菌 – F:尖孢真菌; R: 立枯丝核菌; S: 核盘菌; B: 灰葡萄孢菌。

四种内生真菌对致病菌的抑制作用: - 没有抑制效果; 轻微的抑制效果 ( lt; 50 % ).

1. 真菌菌株的发酵：

以无菌大米为底物进行固体发酵。将PDA 和MEA培养基上培养1 - 2个星期的真菌菌株接种到装有200 g 无菌白米的锥形瓶中。留取一瓶不接种作为空白对照。在室温下静置培养3 - 6星期（时间取决于真菌的生长速度），对培养瓶要进行定期的检查，尽早发现可能被污染的情况。

1. 发酵产物的萃取：

培养一定时间之后，在锥形瓶中额外加入250 ml的EtOAc。用玻璃棒搅匀，再将锥形瓶放到摇床上振摇48 h，用乙酸乙酯萃取，真空抽滤。EtOAc提取物可通过旋转蒸发仪浓缩。得到的提取物在正己烷和90 % 甲醇之间分配。

1. 生物活性
2. 真菌菌株的拮抗作用：

双重培养技术。马铃薯葡萄糖培养基有利于致病性的尖孢镰刀菌（ITCC3636），核盘菌（ITCC6323），灰葡萄孢菌（ITCC7478）和立枯丝核菌（ITCC6822）的生长繁殖。内生菌菌丝打孔（直径为5 mm）和将病原真菌培养物接种于PDA板的周边，彼此相对。把仅接种试验性病原体的培养皿作为空白对照。重复三组实验。接种过后于24 ℃ 下培养5 - 7天后观察，拮抗作用通过生长抑制率来表现。

1. 真菌菌株对抗的细胞毒性：

可以通过MTT法来筛选从毛乌兰中提取的真菌菌株的乙酸乙酯提取物，乙烷和甲醇馏分的细胞毒性是否对Hela 癌细胞的抑制作用。

1. 抑菌机理：

粗真菌提取物与己烷和甲醇馏分的抗真菌活性可通过四种植物致病菌（尖孢镰刀菌，核盘菌，灰葡萄孢菌和立枯丝核菌）的食物中毒技术测定得出。用无菌的移液管分别吸取62.5，125和250 ul的40 mg/ml的原液，然后添加10 ml马铃薯葡萄糖培养基得到250，500和1000 ug/ml的浓度。混合均匀之后倒入无菌培养皿中制平板。利用打孔器，在每一个测试菌株平板中打出5 mm直径大小的孔，接种于培养基中央。平皿倒置于25plusmn;2 ℃下培养，24 h之后观察生长情况，待菌落生长完全之后量出菌落直径大小。将加入250 ul的甲醇制成的平板做空白组。实验重复三次。在对照板上测试真菌对菌丝生长的抑制率。提取物对测试菌株菌丝体 的生长抑制率可以根据空白组的真菌菌株的菌丝生长率计算出来。

1. 抗拒食活性的测定
2. 测试昆虫的收集和饲养：

棉铃虫和斜纹夜蛾的幼虫的饲养在室温下（25plusmn;2 ℃）和相对湿度为75 %的条件下进行，用蓖麻叶去喂养它们直到蛹期。等它们化蛹之后，用10 %的蔗糖溶液混合1 ml复合维生素糖浆去喂养它们，从而可以增强它们的繁殖能力。待饲养到第五龄幼虫时则是用来实验的最佳材料。

1. 生物测定方法：

蒸馏水加 2 %琼脂灭菌之后制成平板，并将平板四等分。在每一等份中间打出一个直径为9 mm的孔为叶子（从新鲜的蓖麻叶中打取）提供支撑。用移液管分别量取10 ul，1000 ug/ul的每一种用甲醇处理过叶子之后得到的真菌提取物和其对照组，在叶子表面交替扩散。斜纹夜蛾轻放在培养皿中间。等待幼虫消耗大约75 %的处理过后或者没处理的叶盘之后，移开幼虫。利用以下公式计算抗拒食活性。

抗拒食活性=[（空白组中消耗的叶子-实验组中消耗的叶子）/（空白组中消耗的叶子 实验组中消耗的叶子）]times;100

1. 结果与讨论

从毛乌兰的叶段分离出六种内生真菌，可用MEA和PDA培养基培养。根据rDNA序列的测定，有四种内生真菌是被成功分离鉴别的。MF1和MF5是被鉴定为绿色木霉， MF3和MF6则被鉴定为是总状共头霉属。而MF2和MF4则没被成功鉴别出来。

内生真菌以及提取物可被视作用于抵抗植物宿主病虫害的保护物质。双重培养技术可以有效地反应出毛乌兰分离出来的四种内生真菌对致病菌的拮抗作用。MF1,MF3,MF5,MF6抑制尖孢真菌，MF1和MF5抑制立枯丝核菌，核盘菌，没有一种真菌可以有效抑制灰葡萄孢菌。

在以大米为基质的培养基固体发酵后用乙酸乙酯萃取得到的产物浓度如表二所

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