肉桂油对黑根霉、黄曲霉和扩展青霉的体内外抑菌活性研究
原文作者：Yage Xing, Xihong Li,* Qinglian Xu, Juan Yun amp; Yaqing Lu
单位：Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin University of Science and Technology, Ministry of Education, Tianjin 300457, China
摘要：采后病原菌如黑根霉、黄曲霉和扩展青霉菌是枣、柑橘果实的致病因子，因此，本研究探索了肉桂油对这些真菌的体外和体内抗真菌活性。肉桂醛是肉桂油的主要成分，肉桂油对黑根霉、黄曲霉和扩展青霉的最低抑制浓度分别为0.64%（v/v）、0.16%（v/v）和0.16%（v/v）。肉桂油对黄曲霉和扩展青霉的抗真菌活性强于对黑根霉的抗真菌活性，且随着肉桂油浓度的增加，其抗真菌活性提高。在体内研究中，2.0%（v/v）和3.0%（v/v）的肉桂油可以分别完全抑制灵武长枣和砂糖橙果实伤口处真菌的生长。这些结果表明，肉桂油作为一种天然的水果抗真菌剂具有良好的潜力。
关键词：抗真菌活性；抗菌剂；精油；食品腐败
1.引言
根霉属、曲霉属和青霉属引起的真菌病是导致采后病害的主要原因，影响水果和蔬菜的质量并缩短其货架期(Quintavalla 和 Vicini，2002年；Wanchaitanawong 等人，2005年； Li 等人，2009年)。这些采后真菌也是枣或橘子果实的致病因子，会导致果实极易腐烂，保质期缩短，采后损失严重。真菌还可能导致真菌毒素的产生和异味的形成(Wanchaitana- wong 等人，2005年)。近年来，许多研究人员都致力于寻找天然抗菌剂。这可能是因为化学防腐剂用作抗菌剂面临着迫在眉睫的问题，还有一个主要问题是真菌对抗生素和化学防腐剂的耐药性增加(Mimica-Dukicacute;等人，2003年；Schelz等人，2006年)。由于人们对健康风险的担忧日益增加，一些化学防腐剂也受到了限制。因此，越来越需要寻找控制果蔬采后病害的替代方法(Takeda 等人，1990年)。最近，精油受到了广泛的欢迎和科学界的关注，精油对食品相关微生物的抗菌活性及其在食品系统中的应用研究也有所增加 (Holley和Patel，2005年；Dorman和Deans，2000年；Deriu 等人，2008年)。肉桂富含肉桂醛、丁香烯、芳樟醇和其他萜烯(Ojagh 等人，2010年)，已被美国食品和药物管理局（FDA）授予食品添加剂安全（GRAS）认证(Vinitha和Ballal，2008年)。肉桂油可用作食品防腐剂，以抑制各种真菌的生长(Matan 等人，2006年；Ooi 等人，2006年)。Soliman和Badeaa (2002年)发现在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，500 ppm的肉桂油可以抑制黄曲霉、寄生曲霉、赭曲霉和串珠镰刀菌的生长。含2%肉桂油的PDA完全抑制了七种产毒素真菌的生长(Azzouz和Bullerman，1982年)。此前有报道称，肉桂油可作为由香蕉炭疽病杆菌、提奥溴酸杆菌和增殖性假丝酵母菌引起的香蕉炭疽病的替代性采后治疗方法(Ranasinghe 等人，2002年)。在Embul香蕉上喷洒肉桂提取物可控制茎腐病，延长货架期(Ranasinghe 等人，2003年)。 Matan 等人 (2006年) 研究结果表明，肉桂油和丁香油在中等水分食品中具有较好的抑菌活性。肉桂油蒸汽改善了草莓和番茄果实品质相关属性，此外，在新鲜农产品储存和运输过程中，肉桂油蒸汽还具有良好的抗菌保护作用(Tzortzakis，2007年)。正如Kyu Kyu Win等人 (2007年)所报道的，浓度为5.0 g/ L的肉桂油可以完全抑制香蕉上所有真菌的分生孢子萌发和菌丝生长。Tzortzakis（2009年）研究了肉桂油（25-500ppm）在体外和体内对炭疽菌、灰霉病菌、草枝孢菌、匍匐茎根霉和黑根霉的抗真菌活性。Tzortzakis（2009年）的研究表明，肉桂油长时间处理可以有效抑制辣椒果实伤口处炭疽菌和灰霉菌的生长。
本研究考察了肉桂油的抑菌性，此外，还对两种果实进行了体内抗真菌活性检测，以进一步了解其抗真菌活性。
2.材料与方法
2.1.材料
肉桂油购自上海翔辉生物科技有限公司。黑根霉(Rhizopus nigricans,R. nigricans)、黄曲霉(Aspergillus flavus,A. flavus)和扩展青霉菌(Penicillium expansum,P. expansum)由天津科技大学生物科学系提供。PDA是从Sigma-Aldrich(Gillingham，英国)公司购买的。
2.2.气相色谱（GC）-质谱仪（MS）分析
本文所述肉桂油的GC分析方法由Wang 等人（2005年）和Adiguzel 等人（2009年）开发。GC所采用的设备为装载VF-5ms MS毛细管柱（30 m·0.25 mm内径，0.25 mu;m）（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托瓦里安市科学仪器服务公司）的Varian GC/MS 4000。对于GC-MS检测，使用电离能量为70 eV的电子电离系统，载气流速为1ml/min，注射器和MS传输线温度分别设置为220和280℃。使用的程序升温速率为8℃/min，温度为60-180℃，恒温10 min，最后在10℃下升温至300℃。手动并以无分流模式注入1.0mu;L的稀释样品（1/10 000，v/v，在己烷中）。根据NIST 05标准和文献日期（Wang等人，2005年），通过比较肉桂油的相对保留时间和质谱，确认肉桂油的主要成分。
2.3.平板培养法测定的最低抑菌浓度（MIC）
使用CLSI推荐的琼脂稀释法进行以下修改：在高压灭菌后，将最终浓度为1%（v/v）的吐温-20（Sigma）加入琼脂培养基中，以提高油的溶解性。在含有1%（v/v）吐温-20的PDA培养皿中，在50℃下制备一系列2倍稀释的肉桂油，范围从2%到0.008%（v/v）。在接种前，将培养皿在35℃下干燥30min，每个培养皿含有约104-105个分生孢子。含1%（v/v）吐温-20但不含肉桂油的PDA用作阳性生长对照。接种的平板在28℃下培养72h得到真菌。MIC被确定为抑制琼脂平板上每种真菌可见生长的肉桂油的最低浓度(Rusenova和Parvanov, 2009年)。
2.4.生长抑制区（ZGI）与肉桂油浓度的关系
琼脂扩散法用于确定抑制区与肉桂油浓度对抑制R. nigricans、A. flavus和P. expansum生长的关系（Wang等人，2005年；Adiguzel等人，2009年）。圆盘（直径10mm）浸渍有10mu;L EO甲醇溶液，含有不同浓度的肉桂油和10mu;L甲醇溶液作为对照。然后将圆盘放置在PDA平板上，该平板上已接种了100mu;L接种物，分别含有分别来自受试真菌R. nigricans、A. flavus和P. expansum的约104-105个分生孢子。将培养板在28℃的培养箱中培养72h，然后用卡尺测量薄膜盘的“抑制区”直径。进行三次实验。
2.5.受伤果体内抗真菌试验
灵武长枣和砂糖橙果实（砂糖橘）在成熟期收获，并根据大小和有无果体伤害或疾病感染进行分类。水果表面用2%（w/v）次氯酸钠消毒3min，然后用自来水冲洗并风干。将果实随机分为50个果实组，每个处理使用三个重复。根据体外抗真菌试验，分别选择0,0.10,0.25,0.50,1.0,2.0和3.0%（v/v）的肉桂油作为体内试验的浓度，以抑制R. nigricans、A. flavus和P. expansum的生长。使用磁力搅拌器将肉桂油和吐温-80（0.2%）的混合物搅拌30min，然后在无菌条件下以21600 rpm的转速均匀化1min（中国上海福禄科设备有限公司）。
Badawy和Rabea（2009年）开发了受伤果实中肉桂油的体内抗真菌测定方法。在果实表皮处用无菌钉子插入（3mm深，3mm宽），每个果实插三处伤口。每个处理有三个重复，每个重复10个果实。然后将20mu;L含精油的乳剂和不含精油的乳剂作为对照分别注射至每个伤口中。1h后，分别向每个伤口添加20mu;L的R. nigricans、A. flavus和P. expansum分生孢子悬浮液（1.0·105分生孢子mL）。将处理过的水果放入200·130·50mm的塑料盒中，用无菌水保持较高的相对湿度（95%）。处理后的枣果和柑橘果分别在25℃下贮藏3天。储存后，记录出现病害症状的伤口数量，并计算发病率（%）
发病率（100%） = 伤口感染数 divide; 每个重复组的总伤口数 times; 100%
2.6.统计分析
使用SPSS 13.0软件（美国伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司）对实验数据进行分析。计算平均值并报告为平均值plusmn;标准差（n=3）。采用单因素方差分析（anova）和最小显著性差异（LSD）检验确定肉桂油体外和体内抗真菌活性的显著性差异（P lt; 0.05）。
3.结果和讨论
3.1.化学组成
采用GC-MS分析法对肉桂油的主要成分及其相对含量进行了研究。如表1所示，肉桂醛是肉桂油中的主要化合物（占76.34%）。每种化合物的检测量都低于12%。这一结果与Wang等人（2005年）的调查结果一致，肉桂醛是肉桂油中的主要化合物。根据Singh等人（1995年）和Wang等人（2005年）的研究结果，肉桂醛是一种抗人类病原体的强抗真菌剂。根据他们的研究结果，肉桂醛可能是一种潜在的先导化合物，通过控制霉菌中beta; -（1,3）- 葡聚糖和几丁质的合成来开发抗真菌药物（Bang等人，2000年）。Schmidt（2006年）曾报道，锡兰桂皮的挥发油富含反式肉桂醛，对动植物病原体、食物中毒和腐败真菌具有抗菌作用（Baratta等人，1998年；Lis Balchin等人，1998年；Mastura等人，1999年；Schmidt，2006年）。因此，肉桂醛可能是肉桂油中主要的抗真菌物质，肉桂油在水果保鲜中的体内外抑菌活性有待进一步研究。
表1肉桂精油的主要成分及其相对含量
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|
化合物 |
RT (min) |
RP (%) |
|
乙苯 |
4.681 |
0.757 |
|
苯乙二醛 |
6.422 |
0.616 |
|
环戊-2-烯-1-酮，2,3,4-三甲基- |
8.765 |
0.933 |
|
苯乙醇 |
9.335 |
0.332 |
|
苯丙醛 |
10.279 |
0.291 |
|
2,3-二氢苯并呋喃- |
11.181 |
1.142 |
|
肉桂醛（E）- |
11.358 |
0.531 |
|
2-甲氧基苯甲醛- |
11.701 |
0.934 |
|
2-丙酮，1-（4-甲氧基苯基）- |
12.120 |
4.349 |
|
肉桂醛 |
12.328 |
76.34 |
|
4-羟基-3-甲基苯乙酮 |
12.927 |
1.206 |
|
2-丙烯酸，3-苯基-甲酯 |
14.200 |
0.226 |
|
1-（2,4,5-三甲基苯基）乙酮- |
15.730 |
0.532 |
|
2-丙烯，3-（2-甲氧基苯基）- |
16.501 |
11.02 |
|
十六酸甲酯 |
21.741 |
0.786 |
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