玫瑰草(Cymbopogon martinii)、茶树(Melaleuca alternifolia)和八角(Illicium verum)精油对扩展青霉的抑制作用及机理外文翻译资料

 2023-03-28 17:04:38

玫瑰草(Cymbopogon martinii)、茶树(Melaleuca alternifolia)和八角(Illicium verum)精油对扩展青霉的抑制作用及机理

Argus Cezar da Rocha Neto, Bruno Bachiega Navarro, Ludiana Canton, Marcelo Maraschin, Robson Marcelo Di Piero

摘要：

扩展青霉在全球范围内可对水果作物造成损害，人们致力于寻找控制它的新途径。本文旨在研究玫瑰草、茶树和八角精油对其的抑制效果并探讨作用机理。将扩展青霉的分生孢子在不同浓度(0.125 g/L-1 g/L)的精油中处理不同时间(1–24 h)后，通过DNA、蛋白质和葡萄糖外渗、脂质损伤、活性氧积累和抗氧化活性等研究测定，来评价体外杀菌或抑菌效果。以红富士苹果为试材，在0.25g/L的精油中作用4h后对真菌孢子萌发有100%的抑制作用，并引起质膜损伤，导致DNA (~69.27 ng)、蛋白质(~39.28 mu;g)和葡萄糖(~5.77 mg)渗漏和脂质损伤(~7.72 pmol of TBARS)。虽然通过测定抗氧化活性这一指标可以发现，精油有效地抑制扩展青霉生长，但在原位观察到的作用很小，说明精油与环境之间有不同的相互作用，会降低了它们的抗菌活性。

关键词：苹果 精油 作用机理 扩展青霉

本文研究的采后化合物：beta;-石竹烯 beta;-月桂烯 茴香醚 钙荧光白 艾草醚 香叶醇 乙酸香叶醇酯 柠檬烯 芳樟醇 罗勒烯 碘化丙啶 硫基乙酸

1引言

苹果的风味和味道一直以来都受到全世界的喜爱。人们不仅食用新鲜苹果，还将其加工成苹果酒、果酱、果汁、醋等，这些用途使得苹果必须增产，从2012年的7000万吨增加到了2014年的8400万吨，它成为了主要的商业化温带水果，是世界上最重要的经济作物之一(Faostat, 2017)。苹果能在寒冷的地方长时间储存(Bekele et al., 2016)，但它们的高糖量、恰当的水活性和pH在其缺乏合适的处理程序时，会导致自身受到真菌病原体的侵蚀，从而影响到质量和销售价值(Li et al., 2017)。苹果采后的主要病害之一是由扩展青霉引起的，它是一种在全球范围内极具侵略性的真菌，能耐受恶劣的环境条件，这种真菌传播迅速，并能产生影响人体健康的真菌毒素，如棒曲霉素(Quaglia, Ederli, Pasqualini, amp; Zazzerini, 2011)。

为了控制采后青霉病，巴西的MAPA介绍了几种合成化学物。然而由于合成化学物对环境和人类健康的不利影响，以及菌株形成了对合成化学品的抗药性，人们需要寻找替代方法(da Rocha Neto, Maraschin, amp; Di Piero, 2015)。在这方面，植物及其分子提取出来的精油备受关注，因为它们通常被FDA认为是安全的，可供人类食用的(Burt, 2004; Prakash, Kedia, Mishra, amp; Dubey, 2015)。然而目前人们只评估了少数精油对青霉属的抑制作用。据我们所知，没有文献涉及到玫瑰草、茶树和八角精油的体内和体外抑菌活性，也没有阐明它们可能的抑菌机制。本文将首次评价上述精油对苹果采后离体和体内上扩展青霉生长的抑制作用并分析其作用机制，为苹果采后控制青霉病提供一种有效、安全的策略。

2 材料和方法

2.1 真菌分离和精油

扩展青霉是从由Rosa Maria Sanhueza (Federal University of Santa Maria, Brazil)鉴定并提供的一种有症状的苹果中分离出来的，这种真菌保存在他们的植物病理学试验室中，代号为Mane 138。在使用前，将扩展青霉接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上在25℃恒温环境下保存两周。随后用苹果汁制备分生孢子悬浮液，借助血球计校准至所需的最终浓度。

在实验使用的不同精油（豆蔻、丁香、古巴香脂、丝柏、尤加利、生姜、薄荷、茶树、玫瑰草、广藿香、苦橙叶、迷迭香、鼠尾草、八角、岩兰草）均从Samia（巴西圣保罗）购得，并按照制造商推荐妥善保存直至使用，并且通过GC/MS、ATRFTIR、DSC和TGA等手段对所选择的精油进行了表征验证。

2.2 精油对扩展青霉的抑菌作用

2.2.1 精油的筛选

用聚乙烯培养皿中评价上述精油的抗菌活性，先制备50 mu;L的孢子悬浮液（105个孢子/mL），加入到每个培养皿中。将滤纸(0.2 mu;m)浸泡在1 g/L的精油中，再把滤纸放置在每个培养皿盖子的内侧，并立即用Parafilm进行双密封，以无菌蒸馏水和1 g/L的醋酸为对照，于25plusmn;1℃、相对湿度较高的条件下孵育24h。每组处理重复四次。用光学显微镜对分生孢子的萌发情况进行测定，重复两次。在此基础上，将聚乙烯培养皿换成玻璃培养皿，保持其他条件不变再进行两次实验。

2.2.2 精油抑制扩展青霉的最低浓度和接触时间

精油的最低浓度按上述方法进行评估后，设立浓度梯度为0.125、0.25、0.5、0.75、1 g/L（茶树、玫瑰草、八角、岩兰草），以无菌蒸馏水和醋酸做对照，分生孢子悬液的培养和鉴定也如前所述，重复三次实验。

探究抑制扩展青霉孢子萌发所需的最小接触时间的实验方法参考了da Rocha Neto et al. (2015)，并稍有改动。制备10 mL孢子悬浮液（2times;108个孢子/mL），并将其添加到每个培养皿中，在培养皿盖子的内侧预先放置了滤纸(0.2 mu;m)，滤纸需提前在0.5 g/L的精油（茶树、玫瑰草、八角、岩兰草）中浸泡过。在室温下培养0、1、2、3、4、5、6 h，分别取样离心（8000 g，5 min，4℃），去除500 mu;L的脂肪，再用50 mm（pH7.0）的磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后用苹果汁（4%）配制成最终浓度为105个孢子/mL的孢子悬浮液，最后对分生孢子的萌发率进行测定。实验重复三次。

2.2.3 精油对扩展青霉的抑制效果

取5 mu;L无菌蒸馏水制备的扩展青霉孢子悬浮液加入到每个含有10 mLPDA的培养皿的中心，在室温下干燥。将0.5 g/L的茶树、玫瑰草、八角、岩兰草精油添加到滤纸上，再将滤纸放在盖子内侧。将培养皿用Parafilm双密封，培养3 d，温度保持在25plusmn;1℃。打开培养皿，除去精油蒸汽，对扩展青霉的菌落进行计数。换上新的不含精油滤纸的盖子后双密封，在25plusmn;1℃下培养4 d，记下扩展青霉的最终菌落数，以蒸馏水做对照，每组重复4个，实验重复三次。

2.3 精油对扩展青霉的抑制作用机理

2.3.1 细胞壁完整性测定

精油对扩展青霉细胞壁影响的实验方法参考Cerioni, Volentini, Prado, Rapisarda, and Rodriguez Montelongo (2010)，并稍作改动。用无菌蒸馏水配制108个分生孢子/mL的孢子悬浮液，并转移10 mL至玻璃培养皿中，在室温下分别暴露于玫瑰草、茶树、八角精油（0.5 g/L）中。在0、1、2、3、4、5、6 h时分别取1 mL样品，离心（8000 g，5 min，4℃），用50 mM（pH7）的磷酸钠缓冲溶液洗涤，再离心（8000 g，5 min，4℃），悬浮于蒸馏水，制成最终浓度为107个分生孢子/mL的孢子悬浮液。在96孔板中加入40 mu;L 0.05 g/L的钙荧光白染色剂和40 mu;L氢氧化钾，再加入悬浮液孵育15 min后，在395 nm和440 nm处测定吸光度，结果在相对荧光单位(RFU)表达。实验重复三次。

2.3.2 质膜完整性测试

探究玫瑰草、茶树和八角精油对扩展青霉细胞质膜完整性影响的实验方法参考了Liu et al. (2007)，并做了一些调整。制备扩展青霉分生孢子悬液，在30℃下用0.01 g/L的碘化丙啶染色5 min。将混合液离心（8000 g，5 min，4℃），用磷酸钠缓冲液洗涤后再二次离心。除去上清液，将沉淀物重新悬浮于无菌蒸馏水中（107个分生孢子/mL）。取300 mu;L最终的分生孢子悬浮液，在546 nm和608 nm处测定吸光度，结果用RFU表达。实验重复三次。

另外，探究精油对质膜损伤程度的实验也根据Rice-Evans, Diplock, and Symons (1991) 和Cerioni et al. (2010)的方法被量化。制备扩展青霉的分生孢子悬浮液，参考2.3.1。为了破坏分生孢子，将悬浮液置于超声波浴中10 min。随后加入1 mL 20%(m/v)的三氯乙酸，在4 ℃下进行沉淀。将混合物离心（19800 g，5 min），取上清液加入2 mL硫代巴比妥酸饱和溶液，置于100 ℃水浴60 min。在冰浴中冷却10 min后在535 nm处测定吸光度。以不含分生孢子提取物的混合液为空白，以156 mmol/cm的摩尔消光系数来测定硫代巴比妥酸反应物质的最终浓度，以蛋白质的浓度(nmol/kg)表达。实验重复两次。

2.3.3 细胞内活性氧积累

探究玫瑰草、茶树、八角精油对扩展青霉分生孢子细胞内活性氧的积累的实验方法参考Li et al. (2017)，并稍作调整。制备分生孢子悬浮液，用10 mu;M双乙酸荧光素染色5 min，离心（8000 g，5 min，4 ℃），用磷酸钠缓冲液洗涤后再二次离心。除去上清液，收集沉淀再悬浮在无菌蒸馏水中（107个分生孢子/mL）。取300 mu;L最终的分生孢子悬浮液到96孔板上，在495 nm和527nm处测定吸光度来评价细胞内活性氧积累。实验重复三次。

2.3.4 扩展青霉的DNA、蛋白质和糖的渗漏

在无菌蒸馏水中制备分生孢子悬液，用苹果汁(4%)调节浓度至5times;105个分生孢子/mL，孵育(25 ℃)3 d。收集6 g扩展青霉菌丝体，用无菌蒸馏水洗涤，并转移到含有玫瑰草、茶树、八角精油的玻璃培养皿，分别于0、1、2、3、4、5、6 h时采集1 mL样品，保存于冰浴中。以牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)为标准，用每公斤菌丝体中可溶性蛋白g表示，参考Bradford (1976)对细胞内蛋白质外渗进行量化。用Nanodrop 1000定量计算细胞内DNA的外渗，结果以DNA g/菌丝 g（times;1.000.000）表示。最后，糖外渗参照Masuko et al. (2005)，以D-葡萄糖为标准，结果以葡萄糖 g/菌丝体kg表示。实验重复两次。

2.4 DPPH抗氧化法

本研究使用DPPH法测定玫瑰草、茶树、八角精油的体外抗氧化活性。将7.9 gDPPH稀释到2.5 mL甲醇中，用80%的甲醇中进一步稀释到1：100(v/v)。同样用甲醇1：4稀释精油。在96孔板中加入290 mu;L DPPH和10 mu;L稀释后的精油，在530 nm处测定吸光度。每组实验重复三次。制备0-40 mM的没食子酸标曲(y = minus;0.0089x 0.4979, R2 = 0.995)来校准样品。

DPPH (%) = 100 – {[(Ac - Aeo)/Ac] x 100}

Ac：DPPH溶液（对照-甲醇溶液）的吸光度

Aeo：精油样品的吸光度

2.5 体内评价精油对扩展青霉的抑制作用

选用的苹果购于COOPERSERRA，用0.5%次氯酸盐消毒2 min，用自来水冲洗并风干。将苹果随机放置在塑料托盘中，用5 mmtimes;1 mm的标准针头在中间扎两个伤口，浸泡在扩展青霉分生孢子悬液（104个分生孢子/mL）中2 min后，立即放入装入水（对照）、0.25 g/L玫瑰草精油、茶树精油、八角精油的塑料托盘中。将托盘放在室温（25plusmn;1℃）和高相对湿度的环境下孵育12 d。参考da Rocha Neto et al. (2015)中的方法观察精油治疗后苹果病变程度，用标准尺每4 d测量一次病斑的直径cm。计算结果以cm/d为单位。实验重复三次。

LGR = Sigma; (theta;t - theta;t-1)/t

theta;代表”t”时间的平均直径

2.6 数据分析

所有的试验是完全随机的，每次治疗都有四次重复（除了文中已指定的）。用Levenes或 Cochran检验分析所有试验中处理方差的均匀度（阶乘或单向），并采用统计软件进行方差分析、F检验（5%）和T检验（ple;0.05）。用到的图形用Mac OS X的Prism 5 software制作。

3 结果和讨论

3.1 精油气相及其抗菌活性

在用到的精油中，有13种具有抗菌活性，使用聚乙烯培养皿时，经验精油对真菌萌发的抑制率为15-40%（图1）；使用玻璃培养皿时，精油的抗菌活性增加，抑制率提高到45-100%。

使用不同材料导致同一精油的抗菌活性存在差异，这可能与挥发物和包装材料之间的三种现象有关，如迁移、渗透和吸附(Sajilata, Savitha, Singhal, amp; Kanetkar, 2007)。有些化合物可以被聚乙烯培养皿吸收，会降低精油的抗菌活性。而玻璃培养皿和精油之间似乎没有发生相互作用，这与Samperio et al. (2010)的结果一致。

由于精油的组成不同

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