基于去保护，添加和随后的环化机理的检测肼的香豆素查尔酮比例荧光探针外文翻译资料

 2022-08-07 11:11:04

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基于去保护，添加和随后的环化机理的检测肼的香豆素查尔酮比例荧光探针

Miaomiao Xing,a Kangnan Wang,a Xiangwen Wu,b Shuyue Ma,a Duxia Cao, *a Ruifang Guan *a and Zhiqiang Liu *c

基于香豆素查尔酮骨架和乙酰丙酸末端基团的肼比例荧光探针，检出限低（0.1 ppb，0.003 mu;M），比例荧光变化大（I465/ I575，1265倍增强），并开发了宽的pH工作范围（3.0-12.0）。对分离出的肼产物进行NMR，HRMS和晶体结构表征的机理分析表明，乙酰丙酸基团首先被去脯氨酸去除。然后在肼的存在下，由于加成反应和随后的环化反应而形成二氢吡唑环。

肼（N2H4）在燃料，燃料电池反应堆，甚至导弹和火箭推进系统中都有广泛的应用。1此外，作为高活性碱和强还原剂，它也被广泛使用用于抗结核，抗糖尿病和除草剂等药物和农药，以及植物生长调节剂。同时，肼在相化学物质，乳化剂，缓蚀剂和纺织染料中也起着至关重要的作用。2但是，肼对有机物具有高毒性，严重污染了环境和土壤。肼还具有优异的水溶性，使其易于通过口腔或皮肤被人体吸收，从而严重损害器官和中枢神经系统。3美国环境保护署（EPA）将肼视为潜在的致癌物质，其阈值限制（TLV）设置为10 ppb。4因此，开发一种可靠，实时且灵敏的方法来检测少量的肼是重要的。

在已开发的检测方法中，包括电化学分析，5毛细管电泳，6色谱7等等，荧光探针由于其灵敏性，方便性，出色的选择性和无害的特性而受到研究人员的特别欢迎。8传统的单发射荧光探针在定量检测中容易受到光强度和光路的影响。9相比之下，比例式荧光探针往往更具优势，并且其双发射信号可以有效避免激发激光功率波动和染色不均引起的干扰，因此比例式荧光探针在定量检测方面更具优势。10比例荧光探针可以克服背景信号，因此在生物学成像方面具有巨大优势。11

尽管荧光探针在肼的检测中具有很大的优势，但报道的例子相对较少。根据近年来有关N2H4的化学传感器的文献报道，根据识别机理，它们大致可分为取代的3c添加剂，1b,2a,3b,5和去保护的2b,c,3a,4,12荧光探针。 13脱保护的荧光探针最常用的分子基团是脂质基团。几乎不涉及其他环化机制。14此外，大多数分析仪的荧光探针识别机制都是基于原位1H NMR，2c,3b,4,5,12aMS2a,12b,15和光谱变化。16尽管有几种探针对于N2H4，其响应机制是基于分离的产物，可以通过晶体结构证明一些。产品的晶体结构是该机理的最直接证明，但由于其不稳定和纯化困难，通常不容易获得。

在这里，我们报告基于香豆素查尔酮骨架和乙酰丙酸的肼的新型比例荧光探针端基，可以高灵敏度检测N2H4。机理分析表明，消除，添加和随后的环化反应负责识别，首次通过二氢吡唑产物的晶体结构证明。与某些已报道的肼化学传感器相比（图S1，ESIdagger;），该探针具有出色的抗干扰性，低检测限（0.1 ppb，0.003 mu;M），大比例荧光变化（I465/ I575），1265倍增强）。更重要的是，该探针可以在pH范围为3.0-12.0的环境中检测肼。宽的pH范围克服了传统荧光探针只能在酸性环境中检测肼的缺点。

以二乙基氨基香豆素羟基查尔酮（R-OH）和乙酰丙酸为起始原料，1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）为缩合剂，4-二甲基氨基吡啶（DMAP）为催化剂合成该化合物（方案 S1，ESIdagger;）。它的特征在于NMR，高分辨率质谱和晶体结构（S1和S2，ESIdagger;）。

该晶体属于三斜晶系和P21/ c空间群。该分子具有一定的平面性，香豆素部分与末端苯基环之间的二面角为36.21°，即使探针具有乙酰丙酸基团的较大替代物（图S3，ESIdagger;）。该分子显示出从二乙基氨基香豆素到末端苯环的轻微电荷转移（图1）。在堆积图中，沿着c轴形成层，并且在每一层中，分子彼此平行，沿着b轴的相邻分子以头到尾的方式排列。在最近的层中，分子也以头到尾的方式排列。

图1探针1的分子结构，R-OH和R（a），X射线分子结构（b），沿轴（c）的堆积图以及探针1（d）的前沿分子轨道HOMO和LUMO。

图2探针1（10 mM）在各种溶剂中的归一化UV-vis吸收（a）和荧光光谱（b，l前= 420 nm）。插图：探头1在自然光（a）和365 nm紫外线下在各种溶剂中的溶液图像

轻（b）（1-己烷，2-甲苯，3-THF，4-丙酮，5-乙腈，6-DMSO，7-甲醇和8-H2O）。

测试了探针的溶剂作用，相应的UV-vis吸收和荧光光谱如图2和图S4（ESIdagger;）所示。除己烷外，探针1在其他各种有机溶剂中均显示出相似的吸收光谱，并具有一个吸收峰。该化合物在420 nm（ε = 6.8times;104M-1cm-1）和440 nm处有两个吸收峰（ε = 6.7times;104M-1cm-1）在己烷中的溶液（图S4，ESIdagger;）。随着有机溶剂极性增加，化合物1的吸收光谱显示出从己烷到水的明显的红移49 nm。溶剂的极性也对探针1的荧光光谱有很大的影响。在365 nm紫外线下，荧光峰的位置显示从己烷到水的129 nm明显红移，溶液颜色从蓝色变成橙色。除正己烷和水外，探针1在大多数溶剂中（图S4，ESIdagger;）具有高量子产率的强力荧强力光发射（甲苯，0.63；THF，0.76；丙酮，0.75；乙腈，0.68；DMSO，0.52；甲醇，0.22）。通过调节溶剂的极性，可以实现从蓝色到橙色的发光。较大的溶剂效应表明探针在基态和激发态均具有高极性。

为了研究探针1对肼的识别特性，使用0.01 M肼水溶液在1（10 mu;M，VHEOES：VDMSO=1:4，pH=7.4）的溶液中进行UV-vis吸收和荧光滴定实验（图3）。从图3a可以看出，随着肼的加入，该化合物在472nm处的吸收峰逐渐降低并且略微红移。当肼达到50当量时，红移最大达到15nm，并且其吸收峰出现在487nm。但是，随着肼的进一步增加，没有红移发生，但是在487nm处的吸光度峰逐渐降低。此外，在肼滴定的整个过程中，在388 nm处出现一个新的峰，吸光度不断提高。当肼的当量数为110当量时达到饱和。根据图3a的插图，随着肼的加入，探针溶液从黄色变为无色，这意味着该探针可以作为肼在水溶液中的裸眼探针。

图3紫外可见吸收（a），荧光（b）光谱变化，竞争选择性（c，（1）探针，探针 N2H4;（2）NaClO;（3）NaCN;（ 4）NaCO3;（5）F-;（6）NaHSO3;（7）NaI;（8）Na3PO4;（9）Na2S;（ 10）氯化钠;(11) Na2SO4;(12) NaSCN;（13）溴化钠；（14）尿素；（15）溴乙胺；(16) (NH4)2S;（17）乙二胺；（18）丙胺；（19）丁胺）和在HEPES / DMSO中加入肼（1：4，v / v）时pH（d）为1（10 mM），l前= 380 nm。

根据图3b的插图，探针溶液本身具有明亮的黄色荧光，随着肼的加入而变成蓝色。575 nm处的荧光峰随肼的加入而减小，同时在465 nm处出现一个新的峰，在100当量时达到最大值。

在加入肼前后，HEPES/DMSO（1∶4，V/V）中探针的量子产率分别为0.43和0.22。此外，当肼的当量数从0增加到40当量时，比加入50～100当量的肼的荧光降低速率明显快。肼荧光比I465/I575从0.006至7.59，1265倍增强。根据图S5（ESI），检测限17可以计算为0.1 ppb，远低于EPA所设定的10 ppb，低于大多数报道的化学传感器（图S1，ESI）。根据UV-Vis吸收和荧光滴定，似乎有两阶段反应。

此外，探索了探针对肼的识别时间（图S6，ESI）。探针在60分钟内与肼（100当量）完全反应，因此在随后的实验中使用60分钟作为识别时间。

为了研究传感机理，还研究了前体化合物R- OH对肼的识别作用（图S7，ESI）。结果表明，该化合物对肼具有类似的识别现象，在388 nm处出现一个新的吸收峰，伴随着487 nm处的原始吸收峰消失，荧光比率I465/I575的比率荧光响应显示202倍增强和1.25 ppb。检出限（图S8，ESI）。探头1比R-OH具有更高的识别灵敏度。肼类化合物的反应时间为220 min（图9、ESI），比探针1长得多。结合探针1的吸收滴定，可以推断当加入50当量的肼时，消除探针1的乙酰丙酸基团，得到化合物R- OH，从而在滴定的早期阶段吸收峰呈现红移。没有羟基的化合物R与R- OH具有相似的结构。化合物R对肼没有明显的识别作用（图S10，ESI），表明羟基在促进识别过程中起着重要的作用。通过与上述光谱的比较，探针1与化合物R- OH相比，在灵敏度、时间响应和强荧光发射方面具有显著优势。

与1和R- OH的滴定图比较，我们相信两种探针对肼的反应产物是相同的。此外，根据探针1的初始滴定光谱中的红移后的线性RO OH的峰位置与线性图案一致的现象，认为探针1的乙酰丙酸基团首先与肼反应形成羟基。过量的肼将被添加到探针1上的碳-碳双键和碳-氧双键，然后发生进一步的环形成反应，如图4所示14d。工作曲线点表明探针1与肼的结合比为1∶1（图S11，ESI）。

图4探针1与肼（A）的反应机理图。肼产物的分子结构（B）和平面性（C）。

为了进一步阐明肼探针1的识别机理，成功地分离出了反应产物，并用1H NMR、13C NMR、HRMS（图S2、ESI）和晶体结构（图4B和C）对其进行了表征，进一步证明了该反应机理。晶体结构清楚地表明了二氢吡唑环的形成和乙酰丙酸的去除。在加入肼后，反应产物具有与探针相同的吸收和荧光光谱（图S12，ESI）。香豆素部分和末端二氢吡唑环在产物结构中存在严重的扭曲，这限制了分子内电荷转移，分子主要表现出香豆素基团的荧光发射。对产品进行了DFT和TDDFT计算。计算出的吸收（341 nm）蓝移到探针1（398 nm），这与实验数据一致。

为了证明探针1的选择性和抗干扰性，在探针1上进行了竞争选择性实验。如图3C所示，当添加其他分析者时，探针的荧光没有显著改变。此外，当添加其它干扰离子和分子时，探针1和肼可以正常反应。结果表明，探头1具有良好的选择性和抗干扰能力。

pH值是影响探针与肼反应的一个重要因素。因此，进行探针鉴定的pH依赖性试验（图3d）。该探针在3～12的pH范围内稳定，在该范围内也具有优异的识别性能。这表明，pH对探针的影响很小，探针可以在很宽的范围内获得肼的优异识别，克服了传统肼荧光探针仅在酸性环境中识别肼的局限性。如表S1（ESI）所示，据我们所知，所报告的最大pH工作范围为5～10。

由于探针对肼具有良好的光谱识别性能，探索了探针1在肼条带测试中的应用。如图13（ESI）所示，暴露于肼后，用探针溶液处理的条带的黄色到蓝色荧光转变发生在3分钟内。同时，随着肼浓度的增加，其蓝色荧光显著增加。

图5用肼（1）、化合物1（10 mm）在肼的加入前后（L<sub

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