青花素A通过调控PI3K/Akt通路抑制GLI1核易位对骨肉瘤发挥抗癌作用外文翻译资料

 2022-08-08 12:01:26

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青花素A通过调控PI3K/Akt通路抑制GLI1核易位对骨肉瘤发挥抗癌作用

摘要

骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，具有复发性或肺转移性，已成为人类死亡的主要原因之一。本次研究对从日本蓝萼香茶菜中分离出的具有生物活性的对映-贝壳杉烷型二萜类化合物蓝萼甲素A的抗癌作用进行了研究，并阐明其作用机制。本次研究中，我们发现蓝萼甲素A抑制了大量骨肉瘤细胞的细胞活力。我们的研究结果表明，蓝萼甲素A对人骨肉瘤细胞、MG-63细胞和HOS细胞均具有促凋亡作用。蓝萼甲素A通过增加Bax/Bcl-2比值、诱发细胞内活性氧(ROS)生成、降低线粒体膜电位(MMP)、诱导caspase-9和caspase-3的裂解等几个步骤开启线粒体凋亡途径，诱导细胞凋亡。我们在体外研究中证实蓝萼甲素A通过表达和敲除GLI1来抑制五锌指Glis 1 (GLI1)的激活，从而诱导细胞凋亡。我们还发现蓝萼甲素A通过调节磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)信号通路来抑制GLI1的激活。我们进一步用PI3K激活剂和抑制剂验证了蓝萼甲素A对PI3K/Akt/GLI1通路的抑制作用，从而证实了我们的发现。此外，我们的体内研究表明，蓝萼甲素A在接种了HOS肿瘤的异种移植瘤模型中具有显著的抗肿瘤作用，且无毒性，其机制与体外相同。综上所述，蓝萼甲素A通过调控PI3K/Akt信号通路抑制GLI1核易位诱导骨肉瘤细胞凋亡。因此，蓝萼甲素A可能是未来治疗人类骨肉瘤潜在的候选药物。

介绍

骨肉瘤是一种流行于青少年和年轻人的原发性骨癌，已成为人类死亡的高风险疾病。虽然也有低级别变异，但大多数是倾向于向肺转移成为恶性肿瘤的高级别变异。目前，标准的疗法是手术切除和化疗，这导致近60%的患者患有局部肢体疾病和20-30%的患者发生原发性转移。高级别骨肉瘤的治疗多采用术前术后化疗、手术切除等方法;然而，在长期时，副作用和毒性可接受的药物的数量十分稀少。

因此，开发新型有效的骨肉瘤治疗药物迫在眉睫。越来越多的证据表明，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路促进了癌症的出现和发展，如肿瘤的发生和增殖、对凋亡的抑制和化疗耐药性。PI3K/Akt通路可通过抑制细胞凋亡，增强细胞对缺氧和营养不足的耐受，因此其与乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤等人类肿瘤的发生和发展有关。PI3K可以催化诱导细胞膜上脂质第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)的生产，导致下游靶点如丝氨酸苏氨酸蛋白激酶Akt11的招募和激活。Akt磷酸化在抗凋亡通路中起关键作用。Akt可以被胰岛素样生长因子1 (IGF1)激活并阻止pten介导的凋亡12,13。Akt的激活还可以通过磷酸化下游靶点蛋白如Bcl-2、caspase-3来抑制细胞凋亡。

PI3K/Akt通路下游蛋白主要调控线粒体外膜的凋亡和控制线粒体外膜通透性的启动。此外，骨肉瘤中PI3K/Akt通路经常被过度激活。抑制PI3K/Akt信号通路可通过下调凋亡抑制蛋白和激活caspase-9和caspase-3促进骨肉瘤细胞的凋亡。因此，PI3K/Akt通路的靶向抗癌药物的开发受到了广泛关注。Hedgehog信号通路对哺乳动物大多数组织和器官的形成，如细胞生长与存活、细胞命运决定、器官形态发生等都有重要影响，并且其与人类肿瘤的发生和发展密切相关。参与Hedgehog信号转导的细胞内因子包括转录因子Cubitus Interruptus (CI)/fivezinc finger Glis (GLI)22。GLI (GLI1和GLI2)是Hedgehog信号通路中重要的转录因子，能调控多个下游靶基因的转录，促进肿瘤进展。许多实验室的研究已经发现GLI能激活多种人类癌症，包括基底细胞癌、成神经管细胞瘤、白血病、胃肠道癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌。因此，我们认为靶向抑制GLI可能有效治疗和预防人类癌症。已有文献证明GLI能够促进骨肉瘤的发展。GLI的核易位可诱导多种上下文特异性基因的表达，如编码d型细胞周期蛋白、c-MYC(也叫MYC)、BCL2和SNAIL(也叫SNAI1)，分别调控细胞的分化、增殖和存活。GLI1/Bcl-2通路与抗凋亡相关，而抗凋亡也伴随着caspase级联解除调控。非典型GLI1的激活受PI3K/Akt信号通路调控，抑制PI3K/Akt/GLI1通路在体外和体内均可诱导肾癌细胞凋亡，并抑制其生长。此外，最近的研究报道，PI3K/Akt可导致体外人食管腺癌细胞OE19中GLI1的激活。因此，PI3K/Akt通路的靶向化疗可以通过抑制GLI激活预防癌症。蓝萼欣A是一种产自日本Rabdosia japonica var.的类黄酮二萜，已知具有多种生物活性，包括抑制血小板聚集、免疫抑制、抗氧化和保护损伤DNA的活性以及细胞毒性活性。蓝萼甲素A可诱导人白血病HL-60细胞和人乳腺癌细胞凋亡。此外，蓝萼甲素A在人恶性胶质瘤U87MG细胞中能以剂量依赖的方式抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。然而，至今未见报道青花素A对骨肉瘤的抗癌作用，其潜在机制也尚不清楚。本研究旨在探讨蓝萼甲素A对人骨肉瘤的抗癌作用及其机制。在体内和体外实验中，我们发现蓝萼甲素A通过调控PI3K/Akt信号通路抑制GLI1的激活，发挥了显著的促凋亡作用。我们的发现表明，蓝萼甲素A可能有一个有吸引力的优势，在未来成为一个有前途的和有效的候选人骨肉瘤治疗药物。

结论

蓝萼甲素A可诱导人骨肉瘤细胞凋亡

蓝萼甲素A的化学结构如所示。我们研究了包括HOS、Saos-2、 U-2OS和mg-63细胞的不同人类骨肉瘤细胞在不同浓度的蓝萼甲素A中24和48 h后的细胞活性，从而评估了蓝萼甲素A对人类骨肉瘤细胞发育能力的抑制作用。在使用蓝萼甲素A进行治疗24h后,HOS、Saos-2、U-2OS和mg-63细胞的IC50(抑制50%细胞的药物浓度)值分别为10.65、14.14、15.69和9.519 mu;M。在经处理48 h后，IC50值分别为7.015、7.316、8.364和5.296 mu;M。我们同样进行了CCK8实验以评估这四种细胞系经蓝萼霉素A处理24和48小时后的细胞活力。CCK8实验也用于评估这四种细胞在蓝萼甲素A处理24和48小时后的细胞活力。CCK8结果进一步证实MG-63和HOS细胞系对蓝萼甲素A更敏感;因此，我们在接下来的实验中选择了这两株细胞系分别用2.5、5和10 mu;M的蓝萼甲素A处理24 h。为了评估我们在体外使用的浓度的安全性，我们检测了蓝萼甲素A对人类正常HEK-293、HUVEC、L02和BEAS-2B细胞的毒性。结果是相同浓度的蓝萼甲素A对HEK-293、HUVEC、L02和BEAS-2B细胞的细胞活力没有显著影响。这些数据表明蓝萼甲素A对骨肉瘤细胞有选择性抑制作用，而对非转化得细胞无选择性抑制作用。

蓝萼甲素A处理后的MG-63细胞呈圆形并破碎，且细胞脱落程度与药物浓度有关。我们采用了DAPI染色法测试蓝萼素A是否能诱导MG-63和pHOS细胞凋亡，以此观察HOS和MG-63细胞在蓝萼甲素A存在24h后的形态学变化。结果显示，对照细胞仍呈圆形，而经蓝萼甲素A处理过的细胞呈凋亡染色质凝聚和DNA片段化的形态学特征，并呈现出剂量依赖性。这些结果表明蓝萼素A对骨肉瘤细胞生长的抑制作用可能与诱导骨肉瘤细胞凋亡有关。我们使用了Annexin V/PI染色法检测蓝萼蓝对细胞凋亡的促进作用。与对照组相比，蓝花萼素A显著增加了ho和MG-63细胞的凋亡率，且呈剂量依赖关系。通过对凋亡细胞百分比的定量分析发现，蓝花素A能显著诱导HOS和MG-63细胞凋亡。此外，我们加入了泛细胞凋亡蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK来验证细胞死亡主要是细胞凋亡蛋白酶依赖的凋亡。结果表明，泛细胞凋亡蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK逆转了蓝萼甲素A对HOS和MG-63细胞的促凋亡作用。我们的数据证明蓝萼甲素A诱导了人骨肉瘤细胞典型的凋亡。

蓝萼甲素A诱导HOS和MG-63发生细胞线粒体介导的凋亡

线粒体的功能对细胞的生存很重要。MMP (Delta;Psi;m )的变化是细胞凋亡早期线粒体功能障碍的标志。为了更进一步研究蓝萼甲素A如何诱导细胞凋亡，我们使用了流式细胞仪检测delta; psi; m。在蓝萼甲素A处理后，细胞平均MMP值显著降低。这个结果表明蓝花素A通过加重骨肉瘤细胞线粒体功能障碍从而诱导细胞凋亡。

氧化应激是引起线粒体功能障碍的重要因素。此外，活性氧(ROS)在细胞凋亡中起关键作用。因此，我们检测了蓝萼甲素A对HOS和MG-63细胞的ROS生成的影响。结果显示，蓝萼甲素A以浓度依赖的方式增加了ROS的产生，表明蓝萼甲素A诱导了细胞内ROS的产生。用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)检测蓝萼甲素A对活性氧产生的影响，结果显示NAC可缓解蓝萼甲素A诱导产生的ROS水平。为了进一步确定因蓝萼甲素A过度产生的ROS的种类，我们测量了骨肉瘤细胞内超氧阴离子(O2.minus;)和过氧化氢(H2O2)的水平。类似于ROS，细胞内的超氧阴离子(O2.minus;)水平可被蓝萼素A升高，并且被NAC逆转，而H2O2水平保持不变。这些结果表明，蓝萼藻素A诱导产生的ROS主要是O2.minus;。

我们通过蛋白质印迹法检测了凋亡相关蛋白如Bcl-2、Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的水平。经在蓝萼甲素A治疗24h后，凋亡蛋白Bax的蛋白表达量升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达量降低，并呈浓度依赖性。Bax/Bcl-2比值是反映线粒体凋亡通路的指标。我们的实验结果显示，蓝萼甲素A显著增加了Bax/Bcl-2的比例。在经蓝萼素A处理后，Caspase-9和caspase-3的裂解被显著激活。此外，Bcl-2和Bax的mRNA水平也受到蓝萼甲素A的相应调控。这些结果表明蓝萼甲素A可诱导骨肉瘤细胞线粒体凋亡。

蓝萼甲素A通过抑制GLI1核易位诱导人骨肉瘤细胞凋亡

GLI负责调节正常的生理活动和许多疾病，如癌症。GLI的激活在肿瘤发生的几个阶段至关重要，当GLI的激活被抑制时，凋亡细胞数量明显增加。而GLI的激活则促进了骨肉瘤的发生。本实验中我们研究了蓝萼甲素A对人骨肉瘤细胞中GLI1激活的抑制作用。蛋白质印迹法的分析结果显示，蓝萼甲素A降低了GLI1的核表达，而提高了GLI1的细胞质表达，并呈浓度依赖性，免疫荧光染色进一步证实了这一结果，其结果显示10 mu;M的蓝萼甲素A抑制了GLI1的核转位。我们进一步用GLI1质粒验证了蓝萼甲素A在体外对细胞凋亡的影响。蛋白质印迹法的分析显示，GLI1质粒会过度表达了GLI1蛋白，并且显著减弱了蓝萼甲素A对MG-63和HOS细胞凋亡的诱导效果。在转染GLI1质粒后，我们检测了蓝萼甲素A对Bax、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表达的影响。在GLI1质粒存在下，蓝萼甲素A对凋亡相关蛋白表达的影响出现明显逆转。我们也在体外用GLI1 siRNA验证了蓝萼甲素A对凋亡的影响。如预期的那样，GLI1 siRNA有效地降低了GLI1蛋白。转染GLI1 siRNA后，蓝萼甲素A对骨肉瘤细胞凋亡和凋亡相关蛋白表达变得几乎没有影响。这些结果表明蓝萼甲素A通过抑制GLI1的核易位而诱导细胞凋亡。

蓝萼甲素A通过调控人骨肉瘤细胞中的PI3K/Akt信号通路抑制GLI1核易位从而诱导细胞凋亡。

已有研究报道，PI3K/Akt信号通路在骨肉瘤进展中起关键作用。我们研究了蓝萼甲素A对PI3K/Akt通路的影响。我们的研究结果表明，蓝萼甲素A可以减少PI3K的蛋白表达以及在HOS和mg-63细胞中的p-Akt。而经蓝萼甲素A处理后，Akt蛋白表达保持不变。我们进一步使用PI3K/Akt信号通路的激活剂和抑制剂-IGF-1和LY294002来确定蓝花素A是否能抑制PI3K/Akt信号通路。20 ng/ml的IGF-1可逆转蓝萼甲素A对PI3K/Akt信号通路的抑制作用。因此上述结果表明，蓝萼甲素A抑制了PI3K/Akt信号通路。

最近的研究表明，PI3K/Akt通路可以调节GLI的活化作用。我们进一步利用IGF-1和LY294002验证蓝萼甲素A是否通过调节PI3K/Akt通路抑制GLI1激活。结果表明:10 mu;M的蓝萼甲素A抑制了GLI1的核转位;然而，IGF-1也撤销了这一作用。此外，蓝萼甲素A和LY294002对PI3K/Akt信号通路和GLI1核转位的抑制作用无显著差异。

我们继续通过IGF-1和LY294002检测蓝萼甲素A是否通过调节PI3K/Akt通路诱导细胞凋亡。20 ng/ml IGF-1可逆转蓝萼甲素A的促凋亡作用。此外，20 ng/ml IGF-1可以使蓝萼甲素A对Bax/Bcl-2比值以及caspase-9和caspase-3裂解率的升高效果消失。蓝萼甲素A和ly294002的促凋亡作用没有显著差异。此外，我们利用PI3K siRNA在体外验证蓝萼甲素A对PI3K信号的影响。PI3K siRNA有效减少PI3K蛋白并且蓝萼甲素A对Akt的磷酸化几乎没有影响。与PI3K核转染后,蓝萼甲素A对细胞凋亡和骨肉瘤细胞凋亡相关蛋白的表达几乎没有任何影响。综上，我们的研究结果表明蓝萼甲素A通过调控PI3K/Akt信号通路抑制GLI1核易位从而诱导细胞凋亡。

在体内，蓝萼甲素A通过调控PI3K/Akt通路，通过抑制GLI1核易位，诱导细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长

为了评价蓝萼甲素A的体内抗癌作用，本研究建立了含HOS细胞的小鼠异种移植瘤模型。经过21天的实验，治疗组与对照组之间的肿瘤体积出现显著差异。蓝萼甲素A显著抑制肿瘤生长，降低了肿瘤体积。为了证明我们之前的结论，我们用TUNEL染色法研究了蓝萼甲素A对骨肉瘤移植瘤的促凋亡作用。我们发现，与对照组相比，蓝萼甲素A处理过的小鼠肿瘤组织中tunel阳性细胞数量明显增加。此外，蓝萼甲素A剂量依赖性地增加了肿瘤组织中Bax/Bcl-2的

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