99mTc标记的聚乙烯亚胺包裹的金纳米颗粒具有pH电荷响应转换特性，可用于增强肿瘤细胞SPECT / CT双模成像外文翻译资料

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^99mTc标记的聚乙烯亚胺包裹的金纳米颗粒具有pH电荷响应转换特性，可用于增强肿瘤细胞SPECT / CT双模成像

Jingyi Zhu,^dagger;,∥ Lingzhou Zhao,^Dagger;,∥ Junxing Yang,^dagger; Liang Chen,^sect; Jianhui Shi,^dagger; Jinhua Zhao,^*,Dagger; and Xiangyang Shi^*,sect;

dagger; 南京工业大学药学院，南京211816

Dagger; 上海交通大学医学院附属上海总医院核医学科，中华人民共和国200080

sect; 东华大学化学化工与生物技术学院，中华人民共和国上海201620

摘要：

由于在肿瘤部位相对较低的积累，导致肿瘤成像效率差，肿瘤双模式造影剂的开发仍然是一个巨大的挑战。在这项研究中，我们构建了功能性的锝- 99m（^99mTc）标记的带有聚乙烯亚胺（PEI）的金纳米颗粒（Au PENs），具有pH响应电荷转换性能，可增强单光子发射计算机断层扫描（SPECT）/计算机断层扫描（CT）癌细胞的双模成像。带有胺官能团（PEI.NH²）的PEI先后用单甲醚和羧基官能化聚乙二醇（mPEG-COOH），马来酰亚胺和琥珀酰亚胺琥珀酸戊二酸酯官能化PEG（MAL-PEG-SVA），二亚乙基三胺五乙酸二酐（DTPA）和异硫氰酸荧光素进行了修饰（FI），并用于将金纳米颗粒截留在内部，然后通过PEG马来酰亚胺与烷氧基苯基酰磺酰胺（APAS）结合，PEI残留表面胺的乙酰化和^99mTc标记。在研究的Au浓度范围内，创建的平均Au核芯平均直径为3.3 nm且具有窄尺寸分布的纳米系统显示出优异的胶体稳定性和所需的细胞相容性。由于附着的APAS部分会对pH响应，具有中性表面电荷的功能化Au PENs可以在微酸性pH条件下切换为带正电，从而可以改善癌细胞对细胞的摄取。凭借这些特性，开发的功能化Au PENs可以在体外实现增强癌细胞双模SPECT / CT成像。所构建的基于PEI的纳米装置可以用于不同优良类型的癌细胞SPECT / CT成像的双模造影剂。

引言：

随着分子成像技术的发展，基于纳米材料的造影剂凭借其精确的结构和独特的理化特性，为实现准确的肿瘤诊断提供了巨大的可能性。因此，开发新型造影剂在深入研究癌症生物学方面显示出巨大潜力。如今，已有各种纳米系统用于早期诊断和治疗癌症。在这些纳米系统中，双模式显像剂具有其独特的优势——能将两种不同的成像模式（例如超声成像，计算机断层扫描（CT），磁共振（MR），单光子发射计算机断层扫描（SPECT），荧光成像和正电子发射断层扫描（PET）进行有效合并。这种合并策略可以极大地补充每种单次成像方式的优势。尽管在空间分辨率，成像灵敏度和组织对比度方面，一系列用于双模式成像的纳米系统显示出了优势，但由于其在肿瘤部位集聚量相对较低，因此极大地限制了成像性能。所以，通过提高纳米材料在癌细胞或肿瘤中的吸收率，来增强成像准确性和敏感性是很有必要的。

众所周知，在微酸性环境下，烷氧基苯基酰基磺酰胺（APAS）可以表面修饰到纳米颗粒（NPs）上，以大大改善其细胞摄取。基于APAS的结构——带负电的亚胺基和带正电的季铵盐铵基团，APAS在生理环境（pH 7.4）下保持中性；而由于磺胺基的质子化，APAS在肿瘤微环境（pH 6.0）中带正电。根据APAS的pH响应电荷转换特性，由于带正电的粒子与带负电的细胞膜之间的静电相互作用，APAS修饰的NP在正常组织中的积累可能有限，在癌细胞和肿瘤中的积累也得以改善. Mizuhara等将修饰的APAS修饰到在pH 6.0上带正电（15 mV）的金（Au）NP表面上，因此在癌细胞中具有相对较高的摄取（45 ng /孔）。

在用于构建双模态成像剂的各种纳米平台中，超支化聚乙烯亚胺（PEI）由于其独特的结构而被广泛使用，该结构可将NP截留在内部空腔中，并在表面胺基团上共轭功能部分。由于其结构上的优势，现已创建了各种基于PEI的双峰成像剂。在我们以前的报告中，通过溶剂热法合成了多功能PEI涂层的Mn3O4 NP，然后在粒子表面用放射性铜-64（⁶⁴Cu）标记以用于靶向肿瘤PET / MR成像。Li等人利用PEI介导的纳米技术开发了Fe₃O₄ @ Au纳米杂交体，用于肿瘤CT / MR成像。Zhao等合成的含氯毒素功能化的PEI包裹的Au NPs（Au PENs）带有碘-131（¹³¹I）标记，用于靶向胶质瘤SPECT / CT成像和放射治疗。综上所述，先前的研究促使人们将PEI作为多功能工具来建立多种用于肿瘤治疗的纳米系统。

受PEI支持的纳米技术和APAS特性的启发，我们设计了具有pH响应电荷转换特性的功能性99mTc标记的Au PEN，以增强癌细胞的SPECT / CT双模成像。 PEI先后用单甲醚和羧基官能化的聚乙二醇（mPEG-COOH），马来酰亚胺和戊二酸琥珀酰亚胺基酯官能化的PEG（MALPEG-SVA），二亚乙基三胺五乙酸二酐（DTPA），异硫氰酸荧光素（FI）进行了修饰，并在凹腔中包裹了金纳米颗粒，然后通过PEG马来酰亚胺与APAS偶联，对备用PEI表面胺进行乙酰化，并进行^99mTc标记（方案1）。形成的APAS-^99mTc-Au PEN通过一系列技术进行了表征。在标记^99mTc之前，我们研究了功能性APAS-Au PEN的基本结构，大小，形态，稳定性和细胞相容性。通过在不同pH条件下的zeta;电位测量来研究pH响应电荷转换效果。 NPs的细胞内在化是通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）和共聚焦显微镜研究的。在标记^99mTc后，测试了所产生的APAS-^99mTc-Au PEN在体外的放射稳定性。最后，将APAS-^99mTc-Au PEN用于癌细胞的SPECT / CT双模成像并对其进行评估。根据我们的文献研究，这是开发用于增强癌细胞双模SPECT / CT成像的APAS-^99mTc-Au PEN的第一个示例。

方案1. APAS-^99mTc-Au PENs的合成示意图

实验部分:

APAS-^99mTc-Au PENs的合成。 根据文献，首先使用相同的方法合成甲磺酸2-（2- {2- [2- [2-（11-三苯甲基硫烷基-十一烷基氧基）-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基）-乙基酯（产物1）和APAS。如支持信息（SI）图S1和S2中所述，三苯甲硫醇和11-溴-1-十一烷醇被用作原料来合成产物1，将其进一步与4-羟基苯磺酰胺和（3-羧丙基）-三甲基氯化铵共轭先后组建APAS。

多功能Au PENs的合成策略与以前的文章相似。首先，PEI.NH²通过EDC偶联化学反应与15摩尔当量的mPEG-COOH反应，然后与15摩尔当量的通过SVA部分等价的MAL-PEG-SVA反应。之后，在连续24小时搅拌下分别添加DTPA（12摩尔当量）和FI（7摩尔当量），得到PEI.NH²-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)。随后，根据文献报道的方法，将形成的PEI.NH²-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)用作纳米平台，包埋金纳米颗粒。简而言之，将200摩尔当量的HAuCl⁴水溶液与PEI.NH²-FI-DTPA-(PEG-MAL)- (mPEG)水溶液混合搅拌30分钟，然后在搅拌下将具有三个摩尔当量的HAuCl₄的NaBH₄溶液添加到上述混合物中3小时以形成{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NH²minus;FI-DTPA- (PEG-MAL)-(mPEG)}PENs。合成的APAS具有10摩尔当量。将其分散在水中并加入到{(Au⁰ )₂₀₀- PEI.NH²FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENs的溶液中。通过搅拌24小时，根据APAS的巯基与MAL-PEG-SVA的MAL部分之间的反应，得到{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NH²-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENs。然后根据我们先前的工作，{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NH²-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENs被乙酰化以中和表面上的胺并生成透析和冻干纯化后的{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NH²-FI-DTPA -(PEG-APAS)-(mPEG)} PENs（简称APAS-Au PENs）。作为对照，还在相同条件下合成了没有APAS结合的纳米系统{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NH²-FI-DTPA -(PEG-MAL)-(mPEG)} PENs（简称Au PENs）。

以APAS-Au PENs上的配体DTPA为基础，按照先前的方法标记了⁹⁹mTc.简而言之，将200 ug的APAS-Au PENs分散在200 ul的水中，并与150 ug的SnCl₂混合。加入150 ul HCl（0.1 M）中的溶液，并添加100 ul无菌Na^99mTcO₄（50 m Ci）并在搅拌下30分钟，此以将^99mTc标记到APAS-Au PENs上。最后，将产物通过PD-10脱盐柱，使用盐水作为流动相进行纯化。没有APAS的^99mTc-Au PENs也使用相同的标记方法制备。在SI中查看完整的实验详细信息。

图1. PEI.NH²-(mPEG)的¹H NMR光谱（a），PEI·NH²-(PEG-MAL)-(mPEG)的¹H NMR光谱（b），PEI·NH²-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)的¹H NMR光谱（C），{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NH²-FI-DTPA-(PEG- APAS)-(mPEG)} PENs的¹H NMR光谱（d）和{(Au⁰)₂₀₀-PEI.NH²-FI-DTPA -(PEG-MAL)-(mPEG)} PENs的¹H NMR光谱（e）,均溶解分散在D₂O中。

图2.（a）分散在水中的APAS-Au PENs（0.5 mg / mL）的紫外-可见光谱； （b）TEM图像；（c）尺寸分布直方图；（d）高分辨率TEM图像；（e）APAS-Au PENs的选定区域电子衍射图； （f）在不同pH条件下浓度为1mu;M的Au PEN或APAS-Au PEN的zeta;电位。

表1.APAS - ^99m Tc-Au PENs在不同时间段的放射化学纯度

结果与讨论:

APAS-^99mTc-Au PENs的合成与表征。如SI图S1和S2中所述，通过一系列取代反应，将三苯基甲硫醇和11-溴-1-十一烷醇用作原料来合成产物1。包括11-三苯甲基磺酰苯并-1-醇，11-（甲磺酸三苯硫基）十一烷基酯，2-（2- {2- [2-（2-（11-三苯甲基硫烷基-十一烷基氧基）-乙氧基]-乙氧基-乙氧基）-乙醇和产物1分别通过¹ H NMR确认（SI图S3）。然后通过取代反应将产物1的磺酸基团与4-羟基苯磺酰胺的羟基缀合，得到4-（（1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧-2-噻戊酸-25）氧基）-苯磺酰胺（产品2），已通过¹ H NMR验证（SI图S4a）。随后，通过产物2与（3-羧丙基）-三甲基氯化铵之间的缩合反应，以及在三氟乙酸的催化下除去三苯甲基的保护基，获得APAS并通过¹ H NMR进行鉴定（SI图S4b）。质谱进一步证实了具有特征分子离子峰（[M H] = 663）的APAS的成功合成（SI

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