长效产氧光疗水凝胶在加强宿主免疫力以抑制乳腺癌的增殖和转移方面的应用外文翻译资料

 2022-08-08 12:07:39

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长效产氧光疗水凝胶在加强宿主免疫力以抑制乳腺癌的增殖和转移方面的应用

药剂1701 林晓宇（译）

关键词：

缓解缺氧 光动力疗法 免疫疗法 抗转移 水凝胶

摘要：

缺氧是有效的肿瘤微环境（TME）因子，可促进免疫抑制和转移过程。对于当前的抗癌治疗策略，缺氧缓解和光动力疗法（PDT）的结合可能是进一步提高抗癌功效的有用方法。在这项研究中，我们使用长效的产氧气光疗水凝胶（POP-Gel）缓解了肿瘤的缺氧，其有效地提高了氧气水平并缩小了肿瘤的缺氧区域长达5天， 光声（PA）成像和免疫荧光染色，满足“一次注射， 持续治疗”策略，显著提高PDT疗效。长期改进肿瘤恶劣环境下调缺氧诱导因子（HIF）-1alpha;和血管内皮生长因子（VEGF），进一步预防肿瘤的生长和转移。更重要的是，增强的PDT引发了更强烈的免疫反应，从而提高了对三阴性乳腺癌的抑制作用，甚至消除肿瘤。 长效产氧光疗水凝胶可能有助于了解缺氧缓解和PDT的结合。

1. 导言

免疫治疗最近在癌症治疗中显示出巨大的前景，特别是对于转移性癌症的治疗，它可以促进宿主的免疫监视和防御，以诱导抗肿瘤免疫，从而消除其余器官组织的损伤。 虽然癌症免疫治疗方面取得了显著进展，但复杂的肿瘤微环境(TME)阻止激活免疫识别肿瘤细胞（免疫抑制），从而降低免疫治疗的效果。 特别是，肿瘤缺氧通过促进免疫逃避和抑制T细胞介导的肿瘤细胞杀伤[2]， 在抑制抗肿瘤免疫中起着关键作用。

近年来，光动力疗法(PDT)作为一种常见的抗肿瘤免疫诱导剂[3- 5]，在光敏剂、组织氧和光的作用下，可以产生单线态氧，它可选择性损伤靶细胞或组织，由于其无创性、高效率和理想的准确性，已成为癌症治疗中一种很有前途的方法[6-8]。 然而，TME的低分氧压力 大大降低了PDT[6]的效率。 为了提供足够的氧气以缓解肿瘤缺氧，研究人员采用了不同的方法来改善TME[9]，如氧梭纳米氟碳[10]、纳米金属-有机骨架[11]、二氧化锰(MnO2)纳米颗粒 [12]、过氧化氢酶[13]、水裂解[14]和呼吸抑制剂[15]。 这些方法 明显提高了供氧和PDT治疗的疗效。 然而，不充分的氧生成量和短期效应不能改善PDT产生的氧耗和肿瘤血管滞塞所导致的加重的低氧环境，因此一种有效并重复使用的PDT是无法支持的。 此外，TME缺氧的发展激发了适应性癌细胞的反应，旨在为治疗抵抗、生存、生长和转移提供优势[16-19]。 而转移是导致癌症相关死亡90%以上的原因。 因此，必须开发一种高效的长期氧传递系统，不仅可以提高PDT的疗效，而且还可以通过改善肿瘤缺氧来增强宿主免疫反应，抑制肿瘤转移。

在此，提出了一种延长制氧光疗水凝胶(POP-Gel)系统，以减轻肿瘤缺氧，增强宿主免疫反应，抑制肿瘤转移和原发肿瘤生长。 我们试图利用聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物F127和F68[21]，是FDA批准的聚合物，需要一种方便简单的方法来制备光敏剂负载的水凝胶，可以方便地注射并留在肿瘤周围，导致大量的光敏剂在肿瘤中积累。 为了获得足够且长时间的氧生成，钙超氧化物(CaO2)并将过氧化氢酶(CAT)引入体系。 由此得到的水凝胶可以调节CaO2的水解反应活性，通过限制水分子进入植入系统，允许氧气产生长达5天，从而满足“一次注射，持续治疗”策略的要求[22]。 体外和体内实验表明，与光疗水凝胶(P-Gel)相比， POP-Gel能产生更多的单线态氧，并显著诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤生长。 更重要的是，POP-Gel可以通过改善肿瘤缺氧介导的PDT免疫原性治疗来显著抑制肿瘤转移。

2. 材料和方法

2.1.材料

过氧化钙(CaO2)和2rsquo;，7rsquo;-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)在从Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO，美国)购买。 过氧化氢酶 (CAT)从Jamp;K化学公司（北京，中国)购买。 泊洛沙姆P407(F127)和泊洛沙姆 P188(F68)是从巴斯夫（路德维希沙芬，德国)购买的。 氯E6是从AdooQ生物科学公司（南京，中国)购买的。 盐酸普莫硝唑 （脱氧探针trade;-1加试剂盒）是从脱氧探针公司（伯灵顿，美国 ）购买的。 杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)、3- (4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四唑溴 (MTT)、4rsquo;、6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)和烟酸己可碱33342是从 KeyGen生物技术公司（南京，中国)购买的。 单胎氧传感器绿色(SOSG)和胎牛血清(FBS)从ThermoFisher科学公司(Waltham，美国)购买。 胰蛋白酶-EDTA（0.25%)是从吉布科(伯灵顿，加拿大)购买的。

2.2.P-凝胶和POP-凝胶的合成

首先制备了浓度为每毫升一毫克的氯E6(Ce6)磷酸盐缓冲溶液(PBS)。 将10毫克Ce6称量后加入到5mLPBS溶液中，在磁力搅拌下加入1MNaOH，直到Ce6完全溶解。 然后用1MHCl将pH调整到7.4。 将溶液转移到10mL 容量瓶中，加入PBS溶液定容至10mL。 P-凝胶和 POP-凝胶是采用“冷法”制备的，并进行了一些修改[21]。 泊洛沙姆407(F127) 还有泊洛沙姆 188 (f68) 二者分开加入 1 毫克每毫升的Ce6PBS溶液，在 4°C下保存24h，得到均相溶液。 最终得到聚合物浓度分别为26%(w/w)F127 和4%(w/w)F68。 用PBS溶液以同一方法制备空白凝胶(Gel)。POP-凝胶和长时间产氧水凝胶(PO-Gel)含有7.5毫克 CaO2和每毫升20000U过氧化氢酶。

2.3.凝胶、P-凝胶和POP-凝胶的表征

用试管倒置法测定了水凝胶的溶胶-凝胶的转变。 流变测量使用流变仪PolyLabOS(ThermoHaake，德国) [23]。 采用无膜模型测定凝胶溶解和药物释放行为。 将1毫升的P-SOL或POP-SOL置于直径为1.5厘米的试管中，在37°C下孵育5分钟至凝胶。 然后在管中缓缓加入1ml37°cPBS(pH=7.4)作为释放介质。 释放研究是在37°C下的恒温摇床(THZ-312，京红，上海，中国)中进行的， 振动速度为50转/分钟。 每30min收集一次释放培养基，测定凝胶的重量(n=3)。 用紫外分光度计(ThermoScientificMultiskanGo， Waltham，MA，USA)测定释放介质中Ce6的浓度。 用紫外分光光度计测定凝胶、P-凝胶和游离Ce6溶液的吸收光谱。 然后测定水凝胶的凝胶化时间。 在直径为5mm的管子中加入500微升空白溶 胶，然后将管子从室温不同时间放入37°C水浴中，直到溶胶转变凝胶[24]。

2.4.PO-凝胶的氧生成

在30mLPBS中注入氮气产生脱氧PBS，时长为20分钟。 首先，将1m LPO-Sol放入25mL烧杯中，在37°C下孵育5min凝胶。 然后，缓缓加入10mL37°C脱氧PBS。 后加入10mL的液体石蜡，分离脱氧 PBS和空气[14]。用便携式溶氧仪(JPBJ-608，Rex，中国)在37°水浴中搅拌(液晶数字7磁性热板搅拌器，MS7-H550-Pro，大 龙，中国)进行检测。 在5、20、40、60、80、100和 120分钟时用过氧化氢检测试剂盒(Beyotime，上海，中国)检测过氧化氢浓度。 为了检测PO-Gel在体外的气泡产生，将空白凝胶和PO-凝胶铺在两张干净的玻片上。 用光学显微镜(Nikonti-s，日本)观察PO-Gel 气泡的产生。

2.5.单线态氧的检测

以脱氧PBS为测定介质，与P-凝胶或POP-凝胶共孵育1h。 培养基中最终Ce6浓度为5mu;g/ mL SOSG为2.5 mu;M[17]。 用PBS、P- 凝胶和POP-凝胶孵育的测量介质在660nm照射下(红色二极管激光660nm，MxLIII-660D，CNI，中国)，功率密度为5 mW每平方厘米，时长为5分钟。 用分光度计(SHIMADZU，RF-5301PC，日本)测定回收的 SOSG荧光(激发=504Nnm)，测定生成的单线态氧。

2.6.细胞摄取Ce6，培养三维球体和细胞毒性试验

细胞摄取试验：在24孔板（每孔格100000）中播种4T1细胞， 与P-凝胶或POP-凝胶在Ce6浓度为10mu;g/mL的条件下孵育4小时， 并且是在常氧条件 (21%O2)或低氧(1%O2)条件情况下。 然后收集细胞并检测细胞摄取Ce6，采用流式细胞仪(BDAccuriC6，美国)和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，LSM700， 卡尔蔡司，德国)。 对于时间依赖性药物摄取，在常氧条件下，4T1细胞与P-凝胶或POP-凝胶孵育1、2、4和 8h。 然后用流式细胞仪和CLSM对细胞进行分析。

三维球体的培养：将200mu;L新制的含有500000个4T1细胞的DMEM培养基 ，加入1.5%琼脂糖凝胶包覆的96孔板的每个孔格中。 每3天加入培养基。 七天后，收集三维细胞球体，与P-凝胶或POP- 凝胶孵育4、12和24h，然后用CLSM测量球体。

细胞毒性试验：P-凝胶和POP-凝胶的体外细胞毒性用MTT法测定4T1细胞。 简单地说，10000个细胞在96孔板中培养，在黑暗中用不同浓度的Ce6处理4h。 一个提前装满氮气的透明盒子放入足够的亚硫酸钠作为低氧箱。 然后将新制脱氧培养基的细胞放置在低氧箱中30min，在功率密度为5mW每平方厘米的情况下暴露于660nm 照射30min。 孵化后24小时后，细胞与含20 mu;L MTT(5 mg/m L)的100mu;L新制培养基孵育4 h。然后用150mu;L DMSO代替培养基，并测定溶液吸光度以评估相对细胞活力。同样，经过氧化氢、凝胶，Ca(OH)2、黑暗处理的Ce6的处理后的细胞活力也用MTT法测定。 采用台盼蓝染色法研究了P-凝胶和POP-凝胶对4T1细胞的体外抗肿瘤作用。 治疗后用 2mu;g/mLP-Gel 或者 POP-Gel进行4小时黑暗处理，细胞经功率密度为5mW每平方厘米的660nm照射30min。 孵育24h之后，用PBS洗涤细胞，用0.4%台盼蓝染色5min，然后用荧光显微镜(Nikonti-s，日本)显示[25]。

2.7.活性氧(ROS)的产生和体外凋亡分析

用DCFH-DA检测P-凝胶和POP-凝胶在缺氧和正常状态下PDT处理后细胞内ROS的产生。 将DCFH-DA与氧化物反应后，它就被氧化为发出绿色荧光的2rsquo;,7rsquo;-二氯荧光素(DCFH)，这一反应可作为ROS检测试剂。 4T1细胞先与P-凝胶和POP-凝胶孵育2h，后与10mu;M DCFH-DA混合30min。用CLSM测量接受照射5min的细胞，或用流式细胞仪收集和检查。

4T1细胞种子在6孔板(每孔格500000 细胞)与浓度为 0.5 mu;g /m L P-Gel 或者 POP-Gel 处理4 h。然后细胞受到5 mW 每平方厘米照射30 分钟，孵育24小时。处理后的细胞轻轻收获，用冰凉 PBS洗涤两次。 然后用AlexaFluor488-AnnexinV 和碘化丙啶 (PI)(FITC AnnexinV凋亡检测试剂盒I，Becton，Dickinson和 Company，美国)在室温下在黑暗中染色15min，用流式细胞技术分析[26]。

2.8.免疫印迹分析

接种于6孔板的细胞与等效Ce6浓度为2mu;g/ml的DMEM、P-Gel或POP-Gel孵育4h。然后细胞在常氧或低氧条件下接受5mWcm-2照射30 min。用总蛋白提取试剂盒(KeyGEN,Nanjing,China)裂解处理细胞，并根据生产商方案提取细胞蛋白。然后，通过12%SDS-PAGE分离30 mu;g蛋白，并转移至硝酸纤维素膜上，在含有5%脱脂乳的Tris缓冲盐水吐温(TBST)中于室温下封闭2h。将膜与其相应的抗HIF-1alpha;一抗(Servicebio,Wuhan,China)在TBST中4 ℃孵育过夜，然后与偶联辣根过氧化物酶的二抗(Beyotime,Shanghai,China)在室温下孵育2h，做免疫印迹。之后，通过增强化学发光(ECL)检测试剂(Tanontrade;High-sig ECL Western Bloting Substrate,Shanghai,China)清洗并显示膜，并通过CCD图像系统(Tanon 4200,China)拍照[27]。

2.9.伤口愈合试验

通过创伤愈合实验检测P-Gel和POP-Gel生成的PDT对4T1细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。将细胞接种到6孔板中，使其生长到 90–95%汇合点。用10 mu;L无菌移液器吸头刮擦融合的单层细胞，形成无细胞区。然后，用等效Ce6浓度为0.1mu;gml-1的P-Gel或POP-Gel孵育细胞4h，接受照射。划痕后未进行任何处理的细胞作为阴性对照组。在0、24和48 h用光学显微镜对不同处理的细胞进行拍照。使用Image J计算伤口愈合率[28]。

2.10. 体内外荧光成像

实验中使用的动物按照实验动物护理原则和实验动物护理和使用指南接受护理。所有动物实验均按照中国药科大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。对4T1荷瘤小鼠（6-8周Balb/c裸鼠）进行荧光成像。100微升P-Gel或POP-Gel(1 mg mL-1)瘤周注射小鼠。然后，在1、2、3、5和7天时对小鼠成像，激发波长为430 nm，发射波长为660 nm(IVISreg;spectrum,PerkinElmer,USA)。在1、2、3和7天，处死小鼠，收获主要器官（心、肝、脾、肺、肾）和肿瘤，进行离体荧光成像。同时对肿瘤进行切片，24 h后采用CLSM观察给药后Ce6渗透情况。

为检测体内凝胶化系统的降解情况，皮下注射100 mu;L POP-Gel(1 mg·mL-1)。解剖小鼠，观察POP-Gel的降解情况并拍

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