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雷公藤甲素通过抑制Rho GTPases的表达破坏基于肌动蛋白的支持生殖细胞粘附连接

王翔a,1，赵芳a吕忠明,1c石维琴c张鲁勇a,b,d,⁎严明a,⁎

a中国药科大学江苏省药物筛选重点实验室，南京210009；

b中国药科大学药品质量控制与药物预警重点实验室，南京；

c江苏省疾病预防控制中心，南京；

d中国药科大学天然药物国家重点实验室，南京210009

摘 要

雷公藤甲素(Triptolide，TP)，来源于药用植物雷公藤(Triterygium Wilfordii Hook)。f.。(TWHF)，是一种具有多种生物活性和药理活性的二萜三环氧化物。然而，TP治疗窗窄，限制了其在临床上的应用，尤其是生殖系统的治疗。在精子发生过程中，支持细胞骨架在促进生殖细胞运动和基于细胞-细胞肌动蛋白的粘附连接(AJ)中起着至关重要的作用。在支持细胞-精子细胞界面，锚定装置是一种AJ，称为胞质特化(ES)。在这项研究中，我们证明了细胞骨架的重要组成部分beta;-肌动蛋白在TP处理后显著下调。TP可抑制Rho GTPase的表达，如RhoA、RhoB、Cdc42和rac1。在Rho GTPase下游，Rho相关蛋白激酶(ROCKS)基因的表达也被TP抑制。F-肌动蛋白免疫荧光证实茶多酚可破坏支持细胞的细胞骨架。beta;-肌动蛋白下调的结果是，TP处理增加了睾丸激素的表达，这表明ES已被分解。 总而言之，该报告说明了TP通过抑制Rho GTPases诱导细胞骨架功能障碍并破坏细胞-细胞粘附连接。综上所述，本报告说明TP通过抑制Rho GTPases诱导细胞骨架功能紊乱，破坏细胞粘附连接。

1.介绍

雷公藤甲素(Triptolide，TP)是从中药雷公藤(Triterygium wilfordii Hook.f.)(TwHF)(Ying等人，2010年)中提取的一种二萜三环氧化物，具有多种生物活性和药理活性，如抗炎(Liu，2011年)、抗癌(Johnson等人，2011年；Liu等人，2013年)、免疫调节(Ho等人，2013年)和促凋亡活性(Liu等人，2013年)，以及抗生育作用(Singla和Challana，2014)。由于治疗窗窄，TP的抗生育作用通常表现为生殖毒性，特别是在男性方面(Li等人，2014年)。

在成年哺乳动物的睾丸中，支持细胞是最重要的体细胞上皮细胞，在结构上支持生精上皮细胞中发育中的生殖细胞，最终生殖细胞通过精子发生的过程发育成精子(Lie等人，2010年)。支持细胞细胞骨架含有微丝、微管和中间丝(Vogl等人，2008年)，它们在物理上和功能上与许多生物学过程有关，例如支持细胞间(紧密连接，TJ)和支持细胞与生殖 (基于细胞肌动蛋白的粘附连接，AJ)细胞界面之间的连接动力学，精子细胞的运输(唐等，2016)和吞噬功能(熊。据悉，研究支持细胞生理学是男性生殖毒理学的一个很好的模式(Reis等人，2015年)。据报道，支持细胞骨架也是睾丸中毒物的主要靶点之一(Li等人，2016年)。

Rho GTPases可以调节细胞骨架网络和连接动力学。哺乳动物Rho GTPase家族含有N10蛋白，如Rho、Rac和Cdc42。许多研究已经证明Rho GTPases可以调节肌动蛋白细胞骨架的组织(Murali和Rajalingam，2014)，支持生殖细胞之间的连接与异常精子发生有关(Lui等人，2003a)。

在精子发生过程中，生殖细胞从生精上皮的基底腔移至下腔。这种细胞伴随着细胞接头（例如TJ，AJ和中间基于细丝的桥粒状接头） 的间歇性拆卸和重新组装（Siu等，2010). 睾丸特异的AJ类型的细胞质专长（ES）也应受Rho GTPases的影响。

以前的研究曾经暗示TP可能是睾丸后男性避孕药的潜在候选药物，并不会影响内分泌(Lue等人，1998年；Hikim等人，2000年)。然而，更多的研究表明，TP可能会对睾丸产生影响。

在最近的一项男性生殖毒性研究中，作者发现10 0mu;g/kgTP可引起睾丸和附睾重量减轻。同时，还观察到生精小管的明显变化。作者还发现附睾中的成熟精子减少(倪等人，2008年)。100mu;g/kgTP处理组大鼠睾丸出现生殖细胞变性和脱落，提示支持生殖细胞AJ可能解体。

在没有形成专门的紧密连接的地方，主动合成并分泌一种新的蛋白质，称为睾丸激素（Grima et al。，1995）。 睾丸激素是由支持细胞分泌的，睾丸的mRNA水平可以反映睾丸间细胞连接的完整性（Grimaetal。，1997）。之后，作者还证明了的表达与支持生殖细胞连接的破坏有关，但与支持间紧密连接无关(Grima等人，1998年)。因此，报道认为是在整个精子发生过程中监测支持-生殖细胞相互作用的一个重要标记物(蔡等人，2012年)。

本研究的目的是评估TP在体内和体外是否具有抑制Rho GTP酶的特性，并确定TP对以肌动蛋白为基础的ES的影响。这些发现支持我们的假设，即TP通过抑制Rho GTPases诱导ES解体，最终导致生精功能障碍。

表格1 本文中用于RT-PCR的引物

材料和方法

材料和抗体

雷公藤甲素(N98%纯度)购自中国北京国家药品生物制品检定所。抗体RhoA、RhoB、Cdc42、rac1/2/3和p-rac1/Cdc42的购自Cell Signating Technology(Rho-GTPase抗体采样器Kit#9968，CST，MA，USA)。

动物与治疗

Sprague Dawley(SD)大鼠购自南京青龙山实验动物公司。动物被饲养在江苏省疾病预防控制中心(中国南京)的温湿度控制设施中。

将雷公藤甲素溶解在10%戊二醇中，然后用0.5%羧甲基纤维素钠(Sigma，MO，USA)稀释。90日龄SD大鼠连续灌胃给予不同剂量TP(0，50，100mu;g/kg体重)4周(Singla和Challana，2014年)，0mu;g/kg组为对照组。

28天后，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(100 mg/kg)进行安乐死。收集睾丸和附睾，取1个附睾进行精子计数。

对大鼠采取的所有措施均符合“实验动物保护和利用指南”(中国动物研究会和“动物保护指南”)。这项研究得到了中国药科大学伦理委员会的批准。

支持细胞，生殖细胞的分离以及支持生殖细胞的共培养

支持细胞是从18-20日龄雄性SD大鼠(Mruk and Cheng，2011a)的睾丸中分离出来的，如前所述(Li and han，2012；Gao et al.，2016)。

简而言之，取大鼠睾丸，去包膜，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗两次。用眼钳将生精小管轻轻散开，然后转移到50ml塑料管中。松弛的生精小管在37°C用0.25%胰蛋白酶消化30min，去除间质细胞和其他间质组织。分离的睾丸碎片在800rpm下离心，在PBS中洗涤两次，然后用0.1%I型胶原酶在37°C下消化30min，去除小管周围细胞。匀浆用100目不锈钢过滤器过滤，收集细胞，800rpm离心5min。细胞在PBS中洗涤3次，然后再悬浮在完全DMEM-F12培养基(Invitgen，MA，美国)中。最后，将分散的细胞以0.5 lowast; 10 ⁵ 细胞/cm ²的密度接种在细胞培养皿上(Grima等人，1998年)，并在37°C、95%空气、5%CO2的潮湿环境中培养，培养48小时后，支持细胞附着在培养皿底部，有微小的树突突出，但大多数生殖细胞悬浮在培养基中，可以通过更换培养基将其移除(Hu等人，2014年)。然后用20 mM Tris，pH 7.4，22°C处理至细胞裂解残留生殖细胞，获得纯度为大于93%的支持细胞。支持细胞纯度分析采用油红O(Sigma，MO，美国)和福尔根(森贝佳，中国南京)染色。在这些条件下，当按照前面描述的各种标准进行评估时，没有形成专门的紧密连接。

无需任何酶处理，即可通过机械程序从90天大的SD大鼠睾丸中分离出生殖细胞（Aravindan等， 1996).将大鼠睾丸分解并在PBS中切碎。离心（100 g，1分钟）后，收集上清液，并将疏松的沉淀物在PBS中洗涤两次，合并上清液。合并的上清液先通过20目过滤筛过滤，然后再通过玻璃棉过滤，以去除细长的精子和精子。最后，我们得到了由精原细胞，精细胞和大部分圆形精子组成的混合物。在DMEM-F12培养基中以及标准条件下培养生殖细胞。

在支持生殖细胞共培养系统中，将支持细胞一起培养5天，形成完整的上皮（Siu等，2005)。然后在第6天将分离的生殖细胞添加到支持细胞上皮中，并以1：1的支持/生殖细胞比率共培养以允许ES组装。

图1. TP的抗生育作用和细胞毒性。A.与对照组相比，TP治疗组中不同精子参数值的降低百分比。用不同浓度的TP（0、50、100mu;g/ kg）处理动物28天。B.暴露于增加剂量的TP（625nM，3300nM） 导致细胞增殖的显着抑制。* P b 0.05，**P b 0.01, ***P b 0.001。

图2. TP干扰Sertoli-germ细胞粘附连接。A.上清液中悬浮细胞的细胞计数。B.上清液中悬浮细胞的细胞活力。C.和D.睾丸素和睾丸支持细胞中的睾丸素基因表达。* P b 0.05，** P b 0.01，*** P b 0.001。

图3-1。在TP处理24小时后，通过FITC鬼笔环肽免疫荧光染色对肌动蛋白细胞骨架重排进行分析。比例尺：25mu;m。A.细胞骨架的正常控制；B.用125 nM TP处理；C.用625nM TP处理；D.用3300 nM TP处理。使用不同批次的Sertoli细胞至少进行了3次免疫荧光分析。每次结果都相似，并给出了代表性实验的数据。阴性对照用于建立必要的实验条件，包括从该分析中排除表型的变化。为了避免实验间的差异，在单个实验过程中处理了用于比较治疗组和相应对照组的所有样品。

2.4细胞处理

以递增浓度(0，5，25，125，625，3000 nM)的TP孵育支持细胞。将TP(100 MM)原液用二甲基亚砜(DMSO)配制，以增加其溶解度。工作液中最高浓度的溶剂(0.1%DMSO)无细胞毒性。孵育24小时后(Lui等人，2003b)，准备细胞以供进一步研究。

2.5细胞活力测定

支持细胞接种于96孔黑色微孔板，密度为0.5times;10⁵个/cm²。用TP处理细胞如上所述，支持细胞的活性由CCK8细胞活性测定(Invitgen，CA，USA)根据制造商的说明进行评估。

2.6.生殖细胞的粘附测定

支持细胞接种于6孔板中，单独培养5d。在第6天，用TP处理支持细胞24h，然后细胞用PBS洗涤后，将生殖细胞负载到支持细胞上。支持生殖细胞在标准条件下共培养48h，以允许ES组装。在结束时，收集上清液(CaO等人，2008)，并根据制造商的说明用Countessreg;自动细胞计数器(Invitgen，CA，USA)对上清液中的细胞进行计数。

2.7.免疫荧光分析

免疫荧光分析：支持细胞接种于6孔板中，每孔含2ml含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基。TP处理后，将细胞置于4%多聚甲醛(w/v)的PBS中室温固定20min，然后用0.1%Triton X-100孵育20min。FITC标记的Phalloidin(YEASEN，中国上海)染色45min。用硫代巴比妥钠洗涤3次后，在Hoechst 34580(美国

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