一种蒽功能化BODIPY衍生物，具有单线态储氧能力，用于光热和连续光动力协同治疗外文翻译资料

 2022-08-08 12:01:20

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一种蒽功能化BODIPY衍生物，具有单线态储氧能力，用于光热和连续光动力协同治疗

朱建伟，邹建华，张杰，孙阳，董晓晨，张琪

光动力治疗(PDT)期间肿瘤组织内光敏过程产生的单极氧（1O2）是自限的。分数传递往往是PDT的一种更好的方法。在这里，在DCM中具有高1O2量子产率(QY)为70%的BDPIA有一个额外的蒽模块用于捕获1O2，这在PDT中很有用。在光周期中，蒽的内过氧化物产生单线氧，而在黑暗周期中，内过氧化物进行热循环还原，产生1O2，再生蒽模块。因此，光动力学过程可以在黑暗时期和光周期中继续进行，保证了其持续的光治疗效果。此外，对于有效的光热治疗，水中的BDPIA光苷酸表现出较高的光热转换效率(Z=38.9%)。 体外MTT试验表明，BDPIA NPs对HeLa细胞的抑制浓度(IC50)为6.293mgmL1。 此外，用慢病毒载体转染HeLa细胞系，用红色荧光蛋白进行实时体内荧光成像引导光治疗。 该模型可以监测BDPIANPs的实时摄取。 结果表明，即使在低剂量(0.2mgkg1)时，BDPIANPs也能抑制细胞增殖，而正常组织（心、肝、脾、肺、肾）则无副作用。 我们的结果表明，具有高光毒性、低暗毒性和优良生物相容性的BDPIANPs可作为一种潜在的光敏剂用于连续光动力和光热协同治疗。

导言

随着现代社会癌症发病率和死亡率的增加，传统的治疗方法，包括手术、化疗和放疗，通常都有固有的局限性，如抵抗力、副作用、低靶向性和缺乏特异性，因此仍然迫切需要有效和创新的癌症治疗方法。在过去的几十年里，光动力疗法(被称为PDT)已经被公认为是治疗各种癌症的一种很有前途的方法[1-13]。治疗过程通常包括单线态氧的光敏生成和肿瘤细胞和肿瘤血管的破坏。然而，PDT本身通过快速消耗细胞内的氧储备而造成急性缺氧，而肿瘤组织通常具有固有的缺氧微环境，导致光敏剂的治疗效果受到限制[14]。许多研究表明，间歇性的传递光可能是一种更好的治疗PDT的方法[6]由于肿瘤的光热效应可以促进肿瘤深处氧的吸收，光敏剂结合光动力疗法和光热疗法，在一定程度上可以克服氧的依赖性。同时，光热效应的辅助作用是在肿瘤中更好地运输和摄取药物的一个优势。因此，通过结合光动力疗法和光热疗法，可以增强治疗效果。考虑到单线态氧是有效PDT所需的细胞毒性剂，其寿命短、仅在照射期产生等特征阻碍了其对肿瘤细胞的影响。14因此，在暗时期应用化学产生的单线态氧对于分数PDT是非常理想的，其中光致敏化的产生是不可能的。事实上，光敏剂和单个分子的化学来源的结合将是一种更明智的方法[15]。

蒽及其衍生物的E内过氧化物已被认为是单线态氧的可靠化学来源，因为它们往往经历清洁的环反转反应没有副反应，以释放单晶态氧与非常高的产量。到目前为止，相关的研究已经报告了蒽内过氧化物的热分解可以产生单线态氧，通过类似细胞凋亡的过程导致细胞死亡[6,10–12]。

双吡咯甲烷，因其高光稳定性和高荧光等而被公认，这使它们成为PDT的潜在候选品[16-29]。然而，它们的单线态制氧能力通常要低得令人失望。共轭重原子可以有效地改善自旋口交叉，从而显著提高单线态产氧量1O2QY。受这些观察的启发，设计和制备了一种蒽接枝双化合物，即BDPIA(3,7-bis((E)-2-(anthracen-9-yl)vinyl)-5,5-difluoro-2,8-diiodo-1,9-dimethyl-10-phenyl-5H-dipyrrolo[1,2-c：20,10-f][1,3,2]-重氮硼-4-氦-5-脲)。该化合物具有70%的高1O2QY，并且蒽模块可用于捕获1O2以在光循环中形成内过氧化物。然而，在黑暗周期中，内过氧化物经历热循环逆转，产生1O2，再生蒽模块可逆的1O2存储和传递可以通过改变光照与否来实现。 同时，采用纳米沉淀法制备了BDPIA的纳米粒子(NPs。 同样，这些NPs能够通过使用单线态氧传感器绿色(SOSG)作为检测探针来显示可逆的1O2捕获和释放能力，有望实现连续PDT。 体外MTT法表明，这种NPs的半数抑制浓度(IC50)为0.3715mgmL1。 此外，体内荧光成像引导光治疗表明，BDPIANPs能够在激光照射下抑制肿瘤的生长，同时对正常组织（心脏、肾脏、肝脏、脾脏和肺)没有副作用）。 结果表明，BDPIA NPs具有良好的生物相容性、低暗毒性和高光毒性，对PTT和连续PDT具有良好的应用前景。

实验

材料和仪器

所有化学品均从西格玛（上海有限公司）购买，无需进一步净化。在298K的CDCL3溶液布鲁克DRXDRR500兆赫光谱仪上测量1H和13C核磁共振光谱，作为溶剂残差(CDCL3，d=7.26)的内部标准核磁共振光谱。紫外光谱被记录在分光光度计上的紫外光谱（日本岛津紫外3600紫外-近红外）。用F-4600光谱仪（日本高温化学仪）测量了荧光光谱。

BDPIA的合成

将BDPI(0.575g、0.1毫摩尔）和蒽-9-卡醛（0.412g、0.2毫摩尔）混合物溶解在DMF（3mL）中，在醋酸（0.4mL）和哌培定（0.4mL）催化下加热至1501C4小时。然后将混合物倒入150mL水中，用二氯甲烷萃取。用盐水洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥。用旋转蒸发除去溶剂，用柱色谱法纯化原油（硅胶，DCM：PE=1：2，v/v）。1高核磁共振(8.44、d、8.39、8.39、8.35、8.21、8.05-8.00、7.06-7.53、7H、7、1H、d)、7.35-2H、m6、6.92、1H、s)、1.60、3H、3H、1.42、3H.s)。13核磁共振（75兆赫，镉3）：137.7,131.6,129.3,129.3,128.4,120.0,117.5,113.6,127.2,111.2,44.2,29.9,29.4,14.4,13.9,12.4。MS：呼叫m/z=764.02；发现m/z=764.10。

DCM和水中的单极态氧检测

以DPBF（1,3-二苯基异苯并呋喃）为1O2指示剂，测定了单线态氧产生能力。 将DPBF的吸光度调整为1.0左右，而BDPIA的吸光度调整为0.2~0.3左右。 将DCM中的BDPIA和DPBF混合物曝光后，记录光谱。 为了研究不受激光照射的单线态氧的产生，用激光(660nm，0.5Wcm2)照射DCM中BDPIA和DPBF的混合物，并记录吸光度。 根据eqn（1）计算单线态氧量子产额，FDeth;samTHORN;SsamSstdFstd Fsam（1）分别指定样品和标准物质。 S代表DPB F(418N m)吸光度随辐照时间的斜率，F可以用F=1-10OD计算(OD表示样品的光密度，MB在660N m处)。

在黑暗中储存5分钟后，再次记录吸光度。 以SOSG为探针，研究了BDPIA NPs在水中的单线态氧生成能力。 激光照射后记录荧光。 在5min后再次记录光谱。 程序重复了三次。

BDPIA纳米颗粒的制备

用纳米沉淀法制备了BDPIA的纳米颗粒。将DSPE-PEG-2000（1mg)和BDPIA（5mg）溶解于THF（1mL）中。然后在室温下剧烈搅拌，将200mL的BDPIA（5mgmL1）加入蒸馏水（5mL）中。然后将该混合物搅拌20分钟，并通过氮气冒泡除去THF。通过离心法获得溶液中的BDPIA钠。根据平方计算了光热转换效率(2)

h是传热系数，s是容器的表面积，从图中得到hs的值。 2d。 Tmax是最大稳态温度下BDPIA NP水溶液的温度变化，I是激光功率，A660是660nm处BDPIA NPs的吸光度，QDis表达了溶剂对光吸收的热量。 变量ts是样本系统时间常数，而MI和Ci是用作溶剂的去离子水的质量和热容量。

红荧光蛋白透病毒载体转染HeLa细胞系

HeLa细胞系（中国CASSIBS生物化学和细胞生物学研究所）在杜尔贝科改良的鹰培养基（DMEM，吉布科）的常规生长培养基中培养，在371C时5%二氧化碳的气氛下补充10%胎牛血清。肺病毒（含红色荧光蛋白，109TUmL1）来自佛摩（中国上海）。盐酸普罗霉素来自碧时生物技术公司（中国上海）。在500mL培养基中植入每个井5104的24井板的细胞。将细胞孵育24小时，然后以一系列浓度接触慢病毒（感染的多样性值为10、20、30、50、70和100）。然后将24井板再孵化48小时。然后去除先前培养基，加入含有5mgm盐酸嘌呤霉素的新新鲜培养基，将24井板连续培养24小时，去除未转染的细胞。利用奥林巴斯IX70倒置显微镜观察荧光图像，评估转染效率，优化的MOI值为50。本研究建立了含有红色荧光蛋白的稳定HeLa细胞系。

MTT测定

对纳米颗粒进行了细胞可行性分析。首先，将NP溶解在蒸馏水中，用DMEM稀释到不同浓度，并分别放入96井板中。然后用激光器（660nm，0.5Wcm2）将96井板照射5分钟。通过比色法和MTT法测定细胞的可行性。每口井加入3-（4,5-二甲基噻唑-2-酰基）-2,5-二苯二苯基四溴化铵(MTT)的蒸馏水（5mgmL1,20mL）溶液，孵化3.5h，在环境温度下加入200mLDMSO。使用热多滑雪板mk3微板读取器在492nm处记录光学吸光率。公式计算细胞生长抑制作用：细胞可行性（%）=（A治疗/A对照）100%。通过对药物浓度绘制细胞生长抑制图，生成细胞生长抑制曲线，使用图垫棱镜6软件（美国拉霍亚公司）确定半最大抑制浓度（半抑制浓度）。

锚合蛋白V-FITC/碘化原(PI)染色

用锚蛋白V-FITC/碘化原(PI)双染色分析细胞凋亡。HeLa电池镀成6井板，分为三组（控制组、照明组和无照明组）。用1mgm1浓度纳米颗粒处理后，用激光（660nm，0.5Wcm2）照射5分钟再孵育24h。最后，用安合蛋白V-FITC/PI细胞凋亡检测套件（中国南京关键生物技术）收获所有HeLa细胞并染色。然后使用流式细胞计（BD生物科学，圣何塞，美国CA）分析细胞的凋亡率。

细胞ROS的细胞摄取和荧光成像

将HeLa细胞与BDPIA NPs(6mgmL1,2mL)在共焦皿中在黑暗中孵育24h，丢弃先前的培养基，然后加入1mL的聚氧乙烯25min。 然后丢弃聚氧乙烯，用PBS洗涤细胞三次。 用2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCF-DA)10mM进一步孵育24h，再用1mLPBS洗涤3次。 该样品用激光(660nm，0.5Wcm2)照射1分钟。 用奥林巴斯IX70倒置显微镜获得荧光图像。 对于细胞摄取，样品在633nm波长处激发，荧光从650nm到750nm。 然而，细胞ROS荧光成像的样品用488nm激光激发，荧光从490到600nm收集。

组织学检查及生物图像治疗

动物伦理批准获得南京医科大学动物中心(中国南京NJMU)。购买12裸鼠，然后将HeLa细胞注射到腋窝作为肿瘤来源。当肿瘤体积达到80mm3时，随机分成3组。对于照明组和无照明组，将小鼠在PBS溶液中静脉注射BDPIANP（60mgmL1,100mL），而对对重复上述过程，直到肿瘤消失。每两天记录一次小鼠的肿瘤体积和体重。最后，我们牺牲了这些裸体小鼠，然后进行了组织学分析。详细地，分离出每只小鼠的肿瘤和主要器官（心脏、肝、脾脏、肺和肾脏），并固定在4%的甲醛溶液中。脱水后，将组织嵌入石蜡盒中，用苏木精和卵球蛋白（Hamp;E）染色；图像记录在显微镜上。肿瘤、心脏、肝、脾、肺和肾脏的生物图像记录在珀金埃尔默IVIS红蛋白K。照组注射生理盐水。4给药几小时后照射照射组肿瘤8分钟，其他两组小鼠不额外照射。

结果与讨论

BDPIA及其NPs的合成、表征

BDPIA的ic路线如图所示。它在结构上完全具有1HNMR、13CNMR和质谱法的特征。一般来说，苯甲酰氯与2,4-二甲基吡咯的反应，然后加入三乙胺和三氟化硼在氯仿和乙酸(三氯甲烷/HOACv/v3：1)混合物处理，产生BDPI。最后，以乙酸和哌啶为催化剂，通过Knoevenagel缩合反应处理BDPI和蒽-9-羧醛，得到BDPIA，产率中等。 如图1a所示。 在THF中，BDPIA的吸光度在628nm处表现出最大强度，而DSPE-PEG-2000包覆的BDPIANPs的红移为55nm，这可以通过溶剂效应或BDPIA的聚集来解释。

图1 图2

图1(a)BDPIA在THF和NPs在水中的归一化吸光度。 (b)DPBF在BDPIA存在下的不同时间降解。 (c)DPBF降解的线性拟合。 (d)DPBF在激光照射存在或不存在的情况下的降解，表明单重照射的情况下产生单线态氧。

图2(a)水中BDPIANP的DLS和TEM图像。(b)带有或不带激光照射的SOSG的荧光增强。(c)带激光照射的水和BDPIANP的温度升高（660nm、0.5Wcm2）。(d)ly的线性拟合和冷却曲线中的时间，显示计算出的光热转换效率为38.9%。

带或不带辐照的单片氧检测

光敏剂的高单线态制氧能力对光动力学治疗至关重要。利用DPBF作为单线氧探针，以二甲基蓝(MB)作为标准物质(DCM中的=57%)来评估BDPIA的单线氧量产率。如图2b和2c所示。与DCM相比，DPBF在BDPIA下的降解速度(660nm，0.5Wcm2)，而M中的MB（图）。S2，ESIdagger;).单线态的收氧率为70%，这可以用所谓的重原子效应来解释。

蒽是一个有趣的组，可以用作1O2探测器。这个过程的机制通常包括在蒽中加入1O2，在光照射下形成蒽内过氧化物。然而，在黑暗条件下，1O2可以从蒽内过氧化物中释放出来，形成蒽，这是一个可逆的过程。[6,12,14]为了研究DCM中BDPIA的1O2存储和释放能力，也报道了DPBF的降解。如图所示。1，DPBF的吸光度随着激光的照射而降低，当溶液在黑暗中再储存5分钟时，也可以观察到进一步的

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