蓝藻生产的青霉素G酰基转移酶及其pga基因的部分遗传分析外文翻译资料

 2022-08-08 12:05:38

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蓝藻生产的青霉素G酰基转移酶及其pga基因的部分遗传分析

摘要：

青霉素酰化酶（青霉素酰胺水解酶，EC 3.5.1.11）是一组在制药工业中具有许多应用的酶，其中之一是生产半合成的beta;-内酰胺类抗生素。该酶主要由细菌产生，但也由某些真菌产生。在本研究中，丝状真菌蓝藻被用于生产青霉素酰基转移酶（PGA）。评估了其在淹没式发酵过程中表达PGA酶的能力，发现该真菌菌株在发酵72小时后以细胞外方式以570 IU / L的水平产生目标生物催化剂。在这种情况下，使用以乳糖为碳源和青霉素G为诱导剂的盐溶液。此外，还对纯蓝藻菌株的pga的DNA片段（859 bp）进行了扩增，测序，并进行了计算机分析。在真菌中鉴定出的pga的部分序列与通过BLAST沉积在NCBI中的青霉素G酰基转移酶序列具有很高的同一性百分比，尤其是来自粪便产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）的PGA的beta;亚基，该区域参与了该蛋白的催化功能。此外，对蓝藻青霉素G酰基转移酶序列域的鉴定显示了该蛋白的三个保守区。生物信息学结果支持该基因鉴定为青霉素G酰基转移酶。这是第一个涉及对编码PGA的蓝藻菌株基因进行测序和计算机分析的报告。

关键词：

生物信息学；酶；发酵；菌类; 蓝藻；青霉素G酰基转移酶。

介绍：

青霉素G酰基转移酶（PGA）（青霉素酰胺水解酶; EC 3.5.1.11）是一种酶，作用于青霉素G，头孢菌素G和其他相关抗生素的侧链以产生抗生素中间体（Maresova等人2014 ; Srirangan等人。2013），例如6-氨基青霉烷酸（6-APA）和7-氨基去乙酸头孢烷酸（7-ADCA），留下苯基乙酸作为公共侧产物（Chandel等人2008）。6-APA是重要的前体，主要是从医学角度出发，因为它可用于生产许多半合成的青霉素，例如氨苄青霉素，奥沙西林和羧苄青霉素（Jiang等，2008 ; Nandi等，2014）。beta;内酰胺抗生素构成最世界抗生素销售的：3times;10 7 公斤/年的总共5times;10 7 公斤/年全世界生产（Chandel等人2008）。因此，PGA的年消费量估计为10-30百万吨，年销售额为150亿美元，占抗生素市场总量的65％（de Souza等，2005； Elander 2003）。工业生产beta;-内酰胺类抗生素现在使用的是生物催化剂工艺，该工艺成本更低且酶转化率更高。据估计，通过青霉素G酰基转移酶可获取超过85％的6-APA（Srirangan等人，2013）。对于工业应用，必须寻找廉价的来源来获得PGA酶。

青霉素酰化酶属于水解酶，是氨基水解酶的一个子类，代表一组所谓的N端亲核水解酶。这些酶需要进行翻译后成熟，以产生功能活性的酶。成熟过程包括去除alpha;和beta;亚基之间的空间肽，然后去除将蛋白质诱导到细胞质的信号肽（Chand等人，2015）。在包括细菌，放线菌，酵母和真菌在内的多种微生物中均发现了青霉素酰化酶活性。目前，已经从40多种不同的微生物中发现了这些酶的产生（Tishkov等人，2010年）。已经有数种微生物作为细胞内青霉素酰基转移酶的产生者被报道：大肠杆菌（休伊特等人，2000年），浑浊醋杆菌（Hernaacute;ndez-Juacute;stiz等人，1999年），无色杆菌属（Plhackova等人2003 ; Skrob等人2003），粪便产碱杆菌（Verhaert等人1997），粘性节杆菌（Konstantinovic等人1994），巴德斯芽孢杆菌（Rajendhran and Gunasekaran 2007）和Providencia rettgeri（Cheng等人2006年）。据报道，巨大芽孢杆菌（Savidge and Cole 1975）和枯草芽孢杆菌（Supartono等人2008）可以在细胞外产生这种酶。另一方面，真菌PGA酶在寻找以天然形式合成该酶以获得较便宜的生物催化剂的生物中受到关注。同样，这些酶表现出令人感兴趣的动力学特征。关于烟曲霉，产黄青霉和灰绿毛霉PGA生产已有研究（Erickson和Bennett 1965；Martinez-Hernaacute;ndez等2003）。例如，与其他PGA相比，青霉素G作为蓝藻 PGA（Martinez-Hernaacute;ndez等人2003）的底物的低Km（1.77times;10-7 M）：PGA（Martinez-Hernaacute;ndez等人，2003年）：巨大芽孢杆菌为1.83times;10-3 M（de Souza等人，2005年），大肠杆菌为7.7times;10-3 M （Savidge和Cole 1975年）。这是一个有趣的发现，因为该动力学参数表明该反应所需的底物更少。

通过克隆和测序细菌中的相应基因，已经确定了文献中描述的几种pga序列。大肠杆菌编码PGA酶基因是最被广泛报道的（Dai等2001 ; Krzeslak等人2009 ;美利奴等人1992）。相反，很少有表达PGA的真菌微生物的报道。蓝藻有潜力在细胞外产生这种酶，促进其纯化并显着降低生产成本。然而，这种真菌的pga序列是未知的。在最近的工作中，由蓝藻生产青霉素G酰基转移酶，并对其pga基因进行了部分分离和生物信息学分析。

材料与方法：

微生物

蓝藻H/55.1.1菌株由甘蔗衍生物研究所（ICIDCA），古巴提供。通过将孢子在马铃薯葡萄糖琼脂上于30°C下培养7天来制备接种物。之后，用无菌盐溶液（FeSO4bull;7H2O 5mgL-1，MnSO4bull;7H2O 15mgL-1，ZnSO4bull;7H2O 30mgL-1，CuSO4bull;5H2O 1mgL-1）并计数到Neubauer室中。

青霉素G酰基转移酶的生产

蓝藻在装有35 mL Czapek液体培养基（gL-1）的锥形瓶中生长：NaNO3（7.4），KHPO4（3），MgSO4·7H2O（1.4），KCl（1.4）和乳糖（30）作为碳源（Schouml;mer等，1984）。将每个烧瓶用1.75times;107孢子mL-1接种，并在30℃下以150 rpm的搅拌和pH 6.5孵育。24小时后，青霉素G（0.5 gL-1加入）作为青霉素酰基转移酶表达的诱导剂。实验一式两份进行120小时，每24小时进行一次评估。产生的生物量通过干重法定量。通过过滤（Whatman 40号滤纸）除去菌丝体，用生理溶液洗涤3次，并在60℃下干燥至恒重。

细胞外PGA活性测定

细胞外青霉素酰基转移酶活性通过Balasingham等人描述的方法测定（1972）。青霉素G水解期间释放的6-APA通过比色法（p -Dab）和在415nm处吸光度（分光光度计，Varian Cary Bio 50）测量。一个国际单位定义为在测定条件下每分钟催化形成1mu;mol6-APA的酶量（Jiang等，2008年）。

蛋白质含量测定

Bradford方法用于确定蛋白质含量（Bradford 1976）。将1毫升的Bradford试剂添加到1 mL样品中（发酵过程中的浓浆）（C蛋白lt;600 mg-1）。在涡旋中搅拌并静置5分钟后，在595nm处测量吸光度。用牛血清白蛋白溶液获得校准曲线。

生物质生产

生物质生产使用液体Czapek培养基在发酵条件下进行。通过将100mL烧瓶中的1times;106孢子mL L-1接种于30mL培养基中，并在30℃下以150rpm恒定搅拌温育6天，一式三份进行发酵。使用带有40号滤纸Whatman的漏斗在无菌条件下获得生物质。一旦获得菌丝体，将其置于铝箔中，并在冰冻条件下保存。

DNA分离和引物设计

使用Doyle和Doyle（1990）的方法从灰质分支杆菌菌丝体分离DNA。通过琼脂糖（1％）凝胶电泳确定DNA的完整性。分离的产品在数字化仪UVP GDS-8000 Mini System Darkroom Labworks 4.5上可视化。使用Valadez和Kahl（2000）提出的方法，在ELISA读板仪Epochtrade;BioTek中添加Take3trade;板进行DNA定量。

选择了来自青霉素G酰基转移酶基因的十二个序列，并储存在NCBI核苷酸平台（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）中。使用来自软件的软件（Chenna等人2003）的ClustalW工具比对这些序列。PGA引物设计使用16至25 bp的共有区域（Chenna等，2003；Sharrocks和Shaw，1992）。使用生物信息学工具Oligoanalyzer 3.1和Primer 3对设计的引物进行了分析，以验证GC含量，异二聚体和同二聚体的形成，叉形的形成以及Tm的确定，以获得最佳的引物并避免非特异性杂交（Chenna等人2003 ; Rozen和Skaletsky 2000； Sharrocks和Shaw1992）。最后，通过Invitrogen Life Technologiesreg;合成引物。

PCR扩增基因

在PX2热循环仪（Thermo Electron Corporation Milford，MA，USA）中获得高质量的DNA（厚，强且无条带）后，进行PCR。对于PCR反应，使用以下试剂制备混合剂：无菌，蒸馏，去离子水14.5mu;L，PCR Buffer 10X（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）2.5mu;L，MgCl2 25 Mm（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA） ）1.0mu;L，10 mM dNTPs（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）0.5mu;l，正向引物10mu;M（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）2.0mu;L，反向引物10pmu;M（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）2.0mu;L ，Taq聚合酶0.5mu;L（Bioline，伦敦，英国）和DNA模板2mu;L。对每对设计引物进行梯度PCR，以确定最佳退火温度。

基因测序和生物信息学分析

使用基于荧光终止子的方法对获得的PCR产物进行测序（Nickerson等，1997）。使用ChromasLitereg;软件分析电泳图序列，并鉴定引物序列。然后，通过应用软件的CAP（Contig组装程序）组装没有引物的正向和反向序列。以识别与同源性从得到的基因片段序列蓝藻，所述序列与存放在NCBI数据库核苷酸序列的PGA相比，使用BLASTN 2.10.0 （Morgulis等人2008 ; Zhang等人。2000）和BLASTX 2.10 .0 （Altschul等人。1997年）。使用NCBI保守域平台（Marchler-Bauer等人2017 ; Marchler-Bauer等人2015）和Pfam数据库（El-Gebali等人2019）检测具有保守残基的区域。使用产生明显比对的氨基酸序列通过MUSCLE方法进行多序列比对。使用MEGA X构建了系统树（Kumar et al.2018）。进化史使用Neighbor-Joining方法推论（Saitou and Nei 1987）。演化距离使用泊松修正方法计算（Zuckerkandl和Pauling 1965）。

结果：

青霉素G酰基转移酶的生产

在液体Czapek培养基中由灰绿莫拉氏菌菌株产生的青霉素酰基转移酶活性动力学示于图1。从培养物上清液中测定青霉素G酰基转移酶（PGA）活性。结果表明，灰绿色支原体菌株证明PGA活性的最大水平（0.57IU ml-1）是在发酵的第三天。

图1：使用Czapek培养基和深层发酵的M. griseocyanus H / 55.1.1产生的生物量和PGA活性的动力学

生物质生产动力学示于图1。该蓝藻菌株在培养的第4天成倍增长，然后达到一个平台期。获得的最大生物量为36 g L-1。在肉汤培养基中发酵期间，蛋白质含量的特征在发酵48至96 h之间增加，然后数值降低（数据未显示）。

引物设计

主要的青霉素G酰基转移酶基因是来源于细菌的。为了鉴定蓝藻中的PGA序列，我们选择了存放在NCBI数据库中的12个pga序列（补充表1）。通过多重序列比对观察到的序列被分为三种不同的相似性模式（数据未显示）。在第一种模式中，发现了巨大芽孢杆菌，粘性节杆菌和巴氏芽孢杆菌微生物。第二个模式是由大肠杆菌的四个PGA序列形成的。在最后一个模式中，pga序列来自无色杆菌CCM 4824，木氧化无色杆菌和粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）对齐。基于这些模式，设计了三对寡核苷酸引物PGA1，PGA2和PGA3（表1），并使用Primer 3软件和Oligoanalyzer 3.1对其进行了计算机内扩增测试。

引物

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