基于聚集诱导发射的硫醇荧光探针及其在活细胞成像中的应用外文翻译资料

 2022-12-17 14:50:02

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基于聚集诱导发射的硫醇荧光探针及其在活细胞成像中的应用

Lu Peng, Zhaojuan Zhou, Ruirui Wei, Kai Li, Panshu Song. Aijun long

Department of Chemisty, Beijing Key Laboratory for Analytica! Methods and Instrumentation. Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chermistry Chemical Biology,Tsinghua Universiry, Beijing 100084. China

摘要:这里报道了一种开启荧光探针DNBS-CSA，其选择性检测硫醇而不是其他氨基酸。探针DNBS-CSA具有广泛使用的硫醇选择性2,4-二硝基苯磺酰基DNBS基团与硫醇反应并释放荧光水杨醛吖嗪与聚集诱导发射（AIE特征。使用AIE染料阻止传感器聚集诱导荧光淬灭对其他硫醇传感器具有挑战性。加入半胱氨酸（Cys至DNBS-CSA的水溶液（含有30％DMSO的pH 7.4的10 mM PBS缓冲液。在558 nm处观察到强烈的荧光增强，具有大的斯托克斯位移）在最佳条件下，荧光强度随着Cys浓度在8-18mu;M范围内线性增加，相关系数R ^ 2 = 0.991。加入Cys后DNBS-CSA的荧光增强在试纸上也观察到了DNBS-CSA作为硫醇检测的固体材料（如试纸）的功能，成功地检测了血清样品中的硫醇.W具有良好的细胞渗透性，将探针应用于HEK 293T细胞中硫醇的成像。

2014 Elsevier Ltd.保留所有权利。

关键词：荧光

1.简介

生物硫醇如半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）在生物和生理过程中起着至关重要的作用[1]。它们的异常水平与许多疾病有关，如肝损伤，皮肤损伤，生长缓慢，癌症和艾滋病[2,3]。因此，硫醇的选择性和灵敏定量是非常重要的。与其他色谱[4]和电化学[5]检测技术相比，选择性和灵敏的硫醇荧光探针由于其在体内研究中的简单性和成像细胞内硫醇的能力而受到越来越多的关注[6-8]。已经利用各种机制构建硫醇的荧光化学传感器，例如迈克尔加成[9-11]，用醛环化[12]，磺酸盐[13-15]和磺酰胺[16]被硫醇裂解[17]等[17] ，18]。关于硫醇对磺酸盐的裂解，已经报道了G.Drewes等人的蛋白质标记2,4-二硝基苯磺酰基（DNBS）。和其他研究人员[19-21]。另外，关于它在硫醇检测中的应用，它首先由H. Maeda等人报道。 DNBS是设计选择性硫醇传感器的有用离去基团，并且有几篇论文证明了硫醇的定量[13-15]。然而，大多数报道的硫醇传感器设计有聚集的荧光团引起的猝灭（ACQ），这将在高传感器浓度或在固态下严重淬灭荧光[22-24]。特别是在生物系统中成像低丰度分子物种时会变得更加严重，因为荧光信号不能通过增加荧光团浓度来增强[22-24]。而且，由于它们的ACQ特性，难以将这些传感器应用于固态（例如在试纸上）的硫醇检测。已知基于纸张的传感器更适合于替代传统分析仪器的即时检验，因为它们简单，便携，便宜，一次性，并且使用低样品量[25-27]。相反，更优选聚集诱导发射（AIE）分子，其将在荧光团的聚集状态下有效发射[28-30]。

许多基于AIE的探针已被用于检测金属离子[31.32]。阴离子[33]，生物分子如肝素[34,35]，L-乳酸[36]，D-葡萄糖[37]等[38]。这些检测方法主要基于产生荧光聚集分子的两种方法。一个是不同电荷的探针和分析物之间的静电吸引[33-36]。另一个是配位络合过程[37]。但是，静电吸引容易受到其他带电物种的影响，从而阻止探针显示出良好的选择性。此外，检测中使用的大多数缓冲溶液必须是酸性或碱性的。探针可以充电，限制在中性pH下的检测。因此，基于它们与分析物的选择性反应的AIE探针将是更优选的。然而，据报道，基于反应的AIE探针[22-24]较少。在此，我们设计了一种新型AIE探针，该探针基于通过硫醇选择性切割探针以产生AIE荧光，用于溶液和试纸上的硫醇的荧光开启检测。

此前，我们小组报道了一系列具有AIE特征的简易合成的水杨醛吖嗪（SA）衍生物[28]并研究了它们在肼[39]，鱼精蛋白[40]和pH [41]检测中的应用。 探针中可旋转NN单键的相邻羟基在其AIE特征中起关键作用：其中的分子内氢键确保其溶液状态下的自由分子内旋转具有荧光猝灭，同时抑制旋转发生在聚集状态下具有荧光 信号打开。

Maeda等已经证明2,4-二硝基苯磺酰基（DNBS）可用于设计硫醇探针[14]。 基于该策略，设计并合成了针对硫醇的荧光开启AIE探针，化合物2-（2，4-磺酰基）5-氯水杨醛吖嗪（DNBS-CSA）（方案1）。 该探针具有5-氯水杨醛吖嗪作为潜在的AIE荧光团和DNBS基团，显示出对硫醇的独特和高反应性，作为识别部分和AIE荧光团的有效猝灭剂[13-15]。 在硫醇在中性pH（或在试纸上）的水溶液中裂解DNBS基团以释放具有羟基的游离CSA后，转动AIE荧光。

2.实验

2.1. 试剂

  1. 氯 - 水杨醛，2; 4-二硝基苯磺酰氯，2-羟基苯甲醛腙和N-乙基马来酰亚胺（NEM）购自商业供应商（Alfa Aesar Co.，Tianjin，China）。 除非另有说明，否则所有其他材料均来自中国北京的国药化学试剂北京有限公司，无需进一步纯化即可使用。 在整个实验中使用分析级的绝对DMSO和去离子水（蒸馏的）。

2.2. 仪器

用JASCO FP-6500和JASCO V-550紫外 - 可见分光光度计（东京，日本）分别记录所有荧光和UV / vis吸收光谱。 所有pH测量均使用Model pHS-3C pH计（Shanghai Precision＆Scientific Instrument Co.Ltd，Shanghai，China）进行。 使用在300MHz下操作的JOEL JNM-ECA300光谱仪（Tokyo，Japan）记录所有NMR光谱。 在不使用液相色谱部分的情况下，在高性能1100液相色谱 - 质谱分析仪（Agilent Technologies，Kyoto，Japan）上获得电喷雾电离质谱。 在配备有电喷雾电离（ESI）源的Shimadzu LCMS-IT-TOF质谱仪（Kyoto，Japan）上获得高分辨率质谱。 用来自Carl Zeiss（LSM 710 META模型）（Oberkochen，德国）的共聚焦显微镜进行细胞成像。

2.3. 2-（2，4-二硝基苯磺酰基）5-氯水杨醛（DNBS-CS）的合成（方案1（a））

向5-氯 - 水杨醛（626.2mg，4.0mmol）的无水CH 2 Cl 2（6mL）溶液中加入Et3N（567mu;L，4.0mmol）。在室温下搅拌60分钟后，将2,4-二硝基苯磺酰氯（1.0664g，4.0mmol）的12mL无水CH 2 Cl 2溶液滴加到反应混合物中。在室温下搅拌过夜后，用30mL H 2 O终止反应。分离有机层并用Na 2 SO 4干燥，然后过滤并真空蒸发。然后加入3mL EtOH，过滤所得沉淀物并用30mL乙醇洗涤。干燥后，得到DNBS-CS，为澄清的黄色固体（316.5mg，21％收率）。 1 H NMR（300MHz，DMSO-d6）：10.05（s，1H），9.14（d，1H，J = 2.4Hz），8.65（dd，1H，J1 = 2.4Hz，J2 = 2.4Hz），8.35（ d，1H，J = 8.6Hz），7.95（d，1H，J = 2.8Hz），7.82（dd，1H，J1 = 2.8Hz，J2 = 2.7Hz），7.32（d，1H，J = 8.9Hz）。 13C NMR（DMSO-d6）delta;（ppm）：187.51,152.26,148.66,147.75,136.17,134.46,134.01,130.86,130.80,130.36,128.23,126.00,121.77。 ESI高分辨率质谱：计算。 C13H7ClN2NaO8S [M Na] 408.9509，实测值：408.9514。

方案1.（a）化合物DNBS-CS，DNBS-CSA和CSA的合成途径。 （b）通过硫醇裂解DNBS- .CSA的磺酰键并产生AIE荧光团CSA。

2.4. 2-（2，4-二硝基苯磺酰基）5-氯水杨醛吖嗪（DNBS-CSA）的合成（方案1（a））

将DNBS-CS（305.6mg，0.8mmol）溶于无水CH 2 Cl 2（10mL）中。然后加入2-羟基苯甲醛腙（108.0mg，0.8mmol）的无水CH 2 Cl 2（4mL）溶液。在室温下搅拌过夜后，立即蒸发溶剂。然后加入3mL EtOH，过滤所得沉淀物并用30mL乙醇洗涤。干燥后，得到DNBS-CSA，为黄色固体（306.9mg，76％收率）。 1H NMR（300MHz，DMSO-d6）：10.87（s，1H），9.12（d，1H，J = 2.4Hz），8.85（s，1H），8.59（m，2H），8.34（d，1H， J = 8.6Hz），8.06（d，1H，J = 2.8Hz），7.69（m，2H），7.40（m，2H），6.96（m，2H）。 13C NMR（DMSO-d6）delta;（ppm）：164.28,159.30,155.0,152.12,148.65,146.68,134.44,134.26,133.73,133.26,131.01（2C），129.44,128.25,128.13,126.18,121.55,120.16,118.59 ，117.08。 ESI质谱：计算。 C20H13ClN4O8S [M H] 505.0，实测值505.2。 ESI高分辨率质谱：计算。 C20H13ClN4NaO8S [M Na] 527.0040，实测值527.0035。

2.5. 5-氯水杨醛吖嗪（CSA）的合成（方案1（a））

将5-氯 - 水杨醛（156.6mg，1.0mmol）溶解在EtOH（10mL）中。 然后加入2-羟基苯甲醛腙（136.2mg，1.0mmol）的EtOH（4mL）溶液。 在室温下搅拌过夜后，过滤所得沉淀物并用30mL乙醇洗涤。 干燥后，得到CSA，为黄色固体（139.7mg，51％收率）。 1H NMR（300MHz，DMSO-d6）：11.17（s，1H），11.08（s，1H），9.02（s，1H），8.95（s，1H），7.77（d，1H，J = 2.4Hz） ，7.71（d，1H，J = 7.6Hz），7.44（d，1H，J = 2.4Hz），7.40（d，1H，J = 7.6Hz），7.00（m，3H）。 13C NMR（DMSO-d6）delta;（ppm）：163.75,161.04,159.23,157.77,133.92,133.11,131.26,129.32,123.65,120.51,120.15,119.01,118.72,117.02。 ESI质谱：计算。 C14H11ClN2O2S [M H] 275.1，实测值275.1。 ESI高分辨率质谱：计算。 C14H10ClN2O2S [M-H] 273.0431，实测值273.0434。

2.6. 荧光研究程序

在绝对DMSO中制备1.0times;10 -2 M探针DNBS-CSA储备溶液。 储备溶液（100mM）的氨基酸（GSH，Cys，Ala，Arg，Gln，Glu，Gly，His，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp和Val），MPA（3-巯基丙酸） 制备在去离子水中的ABT（2-氨基苯硫醇）。 在典型的实验中，通过将6mu;L探针原液置于试管中，用缓冲的DMSO水溶液（10mM PBS，pH7.4）将溶液稀释至2mL，并加入适量的每种氨基酸来制备测试溶液。

2.7. HEK细胞的成像

将HEK 293T（人胚胎肾细胞）在培养基（Dulbecco改良的Eagle培养基，补充有10％胎牛血清，50单位/ mL青霉素和50单位/ mL链霉素）中于37℃在加湿培养箱中培养， 每两天用新鲜培养基更换培养基。 将细胞以每皿104个细胞的密度接种在6cm培养皿中的培养基中。 24小时后，在PBS缓冲液（10mM，pH 7.4）中，在37℃下，不用或用100mu;MNEM处理细胞30分钟。 用PBS缓冲液洗涤除去剩余的NEM后，将细胞进一步与30mu;

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