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 2023-03-12 16:17:12

用基因编码的非天然氨基酸扩展酶领域

原文作者 Ivana Drienovska and Gerard Roelfes

摘要：扩展遗传密码的强大方法的出现允许将非标准氨基酸并入蛋白质的多肽链，从而使酶中引入非自然的化学功能成为可能。从这个角度来看，我们展示了如何使用这种强大的方法来制造具有改进的、新颖的、甚至是新的催化活性的酶。我们概述了目前的技术现状，并讨论了开发和使用含有基因编码的非天然氨基酸的酶与仅含有天然氨基酸的酶相比的潜在益处。

关键词：非天然氨基酸；基因编码；酶的活性；结合位点

酶是极其强大的催化剂，经过数百万年的进化，可以通过催化反应来维持地球生物的生命。人类已经将这些生物催化剂的力量用于自身的应用，生物催化现在被认为是向更可持续的化学合成过渡的关键因素。通过定点突变和定向进化，酶很容易适应非天然底物，甚至催化自然界中不发生的反应。然而，制造酶的20种典型氨基酸（CAA）的结构和功能多样性相对较小，这可能限制了酶的催化功能，至少与合成化学家们可利用的大量化学反应相比是这样的。大自然本身通过利用辅因子和/或标准氨基酸翻译后的修饰来引入新的功能性，并由此引入新的反应性，从而解决了这一问题。这些方法是科学家们寻找新酶的灵感来源。

在过去的二十年里，我们见证了稳健的方法出现，这些方法允许对遗传密码进行重新编程，以便将非自然或非标准氨基酸（NCAA）并入蛋白质中。这种强有力的方法现在也越来越多地应用于生物催化。由此产生的在其肽链中含有非生物功能的外源酶被设想为提供新的生物催化的催化剂，用于催化原则上的任何反应，包括那些对自然界来说是新的反应。

与任何具有如此巨大前景的革命性技术一样，退一步去批判性地评估在生物催化领域使用这种方法的好处是很好的。自然蛋白质序列空间的大小已经远远超出了我们的理解，即使出现了强大的定向进化方法，我们也只对其中的极小部分进行了探索。因此，是否有必要将NCAA纳入蛋白质中，以实现改进和新的酶催化作用？还是我们应该投入更多的时间和资源资源来深入探索现有的序列空间？

从这个角度来看，我们展示了基因编码的NCAA如何被用于提高酶的催化活性和选择性，并可能引起对自然界中没有等价物的反应的催化。最后，我们将讨论与使用标准酶相比，使用基因编码NCAA的酶的益处。

扩展遗传密码方法

除了吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸之外，所有生物体的遗传密码都编码相同的20个氨基酸。多肽中的氨基酸序列由mRNA的核苷酸序列决定。这四个核苷酸可以形成64个三字母密码子，其中61个密码子代表20个CAA，剩下的三个密码子被称为终止密码子，表示翻译停止。因此，为了在体内引入新的NCAA，必须实现额外的密码子或现有密码子的重新编码。已经开发了多种方法，其中选择性压力结合（SPI）和终止密码子抑制（SCS）是最常用的方法（图1）。选择性压力结合依赖于自然翻译机制的混杂性，因为一些转移RNA（tRNA）可以装载结构类似于同源CAA的NCAA上，尽管效率较低。如果生物体本身不能产生cAA（也就是说，它是一种营养缺陷型），它就依赖于外源供应的cAA。如果不存在这些物质，生物体可以使用类似物。这种方法的优点是，只要营养缺陷型菌株可用，它在技术上相当简单。然而，使用该技术可以引入的NCAA数量仅限于接近CAA的结构类似物。此外，这种方法的一个结果是，只能实现全局替换，也就是说，要么全部替换，要么什么都不替换（图1a）。由于折叠结构中的扰动，这通常会导致大量活动和/或稳定性损失。

一个有效的替代方法是SCS方法，它使用三个终止密码子（UAG、UAA、UGA）中的一个，并对其进行重新编码以结合所需的NCAA。由于琥珀色密码子（UAG）在大肠杆菌中使用最少（7–8%），因此它一直是重新编码的首选。终止密码子抑制使用正交翻译系统，即与内源翻译系统没有串扰的翻译系统，包括正交氨酰-tRNA合成酶（aaRS）与针对给定ncAA专门设计的正交tRNA组合（图1b）。例如，来自甲醛酸球菌jannaschi的酪氨酸-tRNA合成酶TyrRS/tRNA对和来自马泽甲藻和巴氏甲藻的吡咯基tRNA合成酶PyrRS/tRNA对被广泛使用。到目前为止，已经有200多个NCAA通过这种方法被结合到蛋白质中。

图1:NCAA体内掺入的两种主要策略的示意图。a、，选择性压力结合法，利用营养不良生物的内源性翻译机制。b，使用正交氨基酰-tRNA合成酶（aaRS）/转移RNA（tRNA）对的NCAA位点特异性掺入的终止密码子抑制方法。正交aaRS/tRNA对被用来重新编码基因中的UAG密码子相关基因的mRNA。使用Biorender创建的图形的通用域名格式。

基因编码NCAA在生物催化中的应用。下面我们将概述基因编码的NCAA在生物催化中的当前应用，并根据这些NCAA对催化活性和选择性的影响进行分类。非标准氨基酸还可用于改善蛋白质的化学或热稳定性，并引入生物正交手柄用于过渡金属催化剂的共轭；然而，这里将不讨论这一点，我们建议读者参考其他最近的报告和评论。

提高天然酶的活性。活性中心结构与催化反应过渡态的互补性是酶实现大速率加速的关键。

因此，正如定向进化研究中经常显示的那样，整体蛋白质结构的任何变化，即使远离活性位点，如果引起活性位点结构的微小变化，也可能对催化产生影响。考虑到这一点，NCAA可用于以cAAs不易实现的方式微调活性位点中的空间和电子相互作用。

事实上，许多研究小组已经表明，使用SPI将CAA整体替换为NCAA可以提高酶的活性和选择性。早在2001年，限制性内切酶PvuII的所有四个苯丙氨酸残基都与o、m和p-氟苯丙氨酸有关。o-和p-氟苯丙氨酸变体表现出相同或更低的活性，而m-氟苯丙氨酸变体表现出比野生型酶高两倍的活性。值得注意的是，苯丙氨酸残基均不属于催化或DNA结合位点。

omega;-转氨酶中的间氟酪氨酸被酪氨酸整体替换，导致（S）-1-苯乙胺合成的稳定性增强和活性增加。巨大芽孢杆菌的细胞色素P450过氧酶和热厌氧菌的脂肪酶中使用了甲硫氨酸及其类似物去甲亮氨酸替代甲硫氨酸，从而产生了活性适度增加2至10倍的变体。

对于SCS，可以进行更多的手术改变，这在原则上可以在CAA不可用的活动部位引入特定的相互作用。例如，硝基还原酶活性部位内的苯丙氨酸残基被几个CAA和NCAA取代。与其他取代物相比，对硝基苯丙氨酸的催化效率（k/K）提高了两倍以上。

报道了二酮还原酶对映选择性的增强，二酮还原酶是一种工业相关酶，能够立体选择性地将酮还原为手性醇。确定了决定底物方向的酶222位的门卫色氨酸残基；加入侧链比色氨酸大的NCAA（色氨酸是标准池中体积最大的AA），如邻叔丁基酪氨酸和对苯丙氨酸在该位置的结合增强了对映选择性。有趣的是，较小的侧链导致对S对映体的对映选择性反转。

Fasan及其同事报道，用细胞色素P450中的对氨基苯丙氨酸替换活性位点Leu75，导致（S）-布洛芬的氧化显著增加。此外，将NCAA置于Ala82的位置导致（ ）-nootkatone氧化的产率显著增加。最后，当对乙酰苯丙氨酸位于Ala78位置时，观察到（ ）-nootkatone完全立体选择性氧化为（9R）-羟基nootkatone，这在天然酶中是不可能的。

产自嗜酸脂环杆菌的角鲨烯-霍普烯环化酶催化角鲨烯线性分子多环化为多环三萜。活性位点残基Phe365和Phe605被提议用于稳定多环化级联反应中形成的阳离子中间体，酶的活性与其活性位点中阳离子-pi;相互作用的强度有关。o-甲基酪氨酸和单、二、三氟苯基丙氨酸在这两个位置结合。氟苯丙氨酸减少阳离子minus;pi;结合相互作用，因此，反应变得更慢。相比之下，o-甲基酪氨酸增强了这些相互作用，并且在低于40°C的温度下，获得了更活跃的酶。

研究还表明，在细菌磷酸三酯酶（arPTE）中，用1-（7-羟基香豆素-4-基）乙基甘氨酸（Hco）取代Tyr309，可使其转化率提高八倍，以水解农药对氧磷。结果表明，这与决定速率的产物释放步骤的速率增加有关，这是由于Hco与产物之间的电荷排斥增加所致，Hco的侧链pK低于Tyr。

以前使用cAAs优化这种酶活性的尝试并没有产生改良的变体。

尽管在前面的例子中，NCAA是在预定位置引入的，但NCAA也被用于定向进化酶中。一个单取代突变酶库报导了，在TEM-1beta;-内酰胺酶中随机引入十种结构不同的NCAA。通过对beta;-内酰胺类抗生素头孢氨苄的生长筛选，发现缬氨酸-216上存在一种独特的对丙烯酰胺苯丙氨酸突变，其催化效率提高了八倍。相比之下，在这个位置的天然氨基酸没有提供类似的增强。

辅助功能。酶通常含有氨基酸，这些氨基酸具有支持催化的辅助功能，包括介导电子转移和电子与质子穿梭。例如，酪氨酸（Tyr）在酶促反应中具有同时提供电子和质子的独特能力。非标准氨基酸可以用来调节这些性质，并已被证明是强有力的生物物理探针，用于破译此类氨基酸在催化机制中的作用。在里程碑式的研究中，Stubbe及其同事使用了多种非标准酪氨酸类似物，如3,4-二羟基苯丙氨酸、间氨基酪氨酸、间硝基酪氨酸或氟酪氨酸，跨越一系列氧化电位，以阐明核糖核苷酸还原酶中的电子转移途径。

为了研究Tyr在细胞色素c氧化酶中的辅助作用，将两种组氨酸（His29和His43）和一种Tyr（Tyr33）引入抹香鲸肌红蛋白（Mb）的远端囊中，制备了该酶的功能模型。接下来，通过用三种卤化酪氨酸类似物取代引入的Tyr33，创建了不同的工程肌红蛋白变体：3-氯酪氨酸（ClTyr）、3,5-二氟酪氨酸（F2Tyr）和2,3,5-三氟酪氨酸（F3Tyr），它们的pK值都低于酪氨酸。3-甲氧基酪氨酸（MeOTyr）的pK与酪氨酸相似，但还原电位显著降低。结果表明，模型氧化酶的催化活性强烈依赖于Tyr33的pK值及其还原电位，从而证实了Tyr在氧化酶反应中的重要作用。除上述内容外，3-甲基酪氨酸（MtTyr）和MeOTyr对阐明Tyr417在非血红素铁酶（OvoA）中的功能有显著贡献，该酶催化l-His和l-Cys之间的四电子氧化偶联。

自然界本身也通过翻译后修饰来调节酪氨酸的性质，以优化其催化性质。教科书中的例子是半乳糖氧化酶中酪氨酸-半胱氨酸交联的翻译后形成，这是其将多种醇氧化为相应醛类的关键，伴随着O还原为HO。一般来说，很难在其他酶中产生这些修饰；然而，NCAA可用于模拟此类修饰，以研究其机理或开发这些修饰在催化中的潜力（图2a）。例如，SCS方法已被用于将2-氨基-3-（4-羟基-3（1H-咪唑-1-基）苯基）丙酸（亚氨基-1-苯基）并入抹香鲸肌红蛋白中，该肌红蛋白模仿Tyr–His，这是血红素铜氧化酶（HCO）功能所必需的交联。变异型Mb_Phe33miTyr是HCO的功能模型，其耗氧率为2.2分钟，与Mb_Phe33Tyr相比，O的还原速度快了三倍，后者在相同位置有酪氨酸，但缺少Tyr-His连接。此外，这种改进的变体还释放出较少的活性氧物种作为副产物。作为酪氨酸-半胱氨酸交联（存在于各种金属酶中）的模拟物，Wang及其同事在肌红蛋白的33位引入了3-甲基硫代酪氨酸（MtSTyr），从而产生了一种酶，该酶以800分钟的速率催化选择性羟胺还原为氨（参考文献）。

图2:NCAA的辅助功能。a， 2-氨基-3-（4-羟基-3-（1H-咪唑-1-基）苯基）丙酸（亚胺酪）和3-甲基硫代酪氨酸（MtSTyr）分别作为Tyr-His和Tyr-Cys交联的模拟物。当MtSTyr被加入到工程抹香鲸肌红蛋白（Mb，PDB:4FWX）中时，Mb33MtSTyr可以高效地催化羟胺还原为氨。b，人工荧光蛋白是将二苯甲酮丙氨酸（BpA）掺入超荧光黄荧光蛋白（PDB:3ED8）中，与有机镍-三联吡啶辅因子结合形成的一种高效的共光还原催化剂。据报道，最佳变型PSP2_95C_93Y97Y（参考文献）的周转量（吨）为120。c，NCAA可以通过掺入光老化或光开关氨基酸来控制酶的活性。其中，最常见的是通过紫外线照射将苄基或硝基残基分解。在这里，将TEV蛋白酶（C151）的催化半胱氨酸封闭会产生一种非活性酶，该酶通过光去除封闭基团而被激活。

除了模仿自然翻译后的修饰外，还可以引入包含ncAA的组，这些组在本质上具有没有等效功能的辅助功能。Wang和同事将一个Tyr66超荧光黄蛋白与一个侧链含有二苯甲酮（BpA）的ncAA交换。二苯甲酮是有机光催化中常用的光敏剂。在野生型蛋白质中，Tyr66通过三肽Gly65-Tyr66-Gly67的自催化转化参与生成高荧光的对羟基苄叉-5-亚胺二唑啉酮物种。根据设想，BpA66可以进行相同的转换，从而产生（E）minus;4-（4-苯甲酰苄叉）-1,2-二甲基-1H-咪唑-5（4H）-酮，一种寿命显著延长的生色团。

在与牺牲还原剂反应后，三重态激发态转变为具有极低氧化还原电位minus;1.5V的超还原自由基。通过将这种人工荧光蛋白与有机镍-三联吡啶辅因子结合，获得光能以超过100个总转化数和2.6%的量子产率减少CO，这高于大多数报道的CO光还原催化剂（图2b）。

SCS方法还允许加入可用于控制催化活性的非生物部分。这允许对复杂细胞系统中的蛋白质活动进行非侵入性的时空控制。最常用的策略之一依赖于特定地点纳入笼状ncAA，

图3 NCAA作为金属结合和金属配位残留物。a， 含有金属结合部分的ncAA作为金属酶中的附加配体进行基因掺入（顶部）或通过引入金属结合ncAA（底部）创建新的金属结合位点的示意图。b，将（2,2-联吡啶-5yl）丙氨酸（BpyA）掺入乳球菌多药耐药调节剂（LmrR，PDB:3F8F）和季铵化合物调节剂（QacR）（PDB:1JTY）。这些新型金属酶催化

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