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黑曲霉alpha;- 葡萄糖苷酶Asn694突变对水解和转糖基化的影响

Min Ma ¹＆ Masayuki Okuyama ¹＆Megumi Sato ¹＆Takayoshi Tagami ¹＆Patcharapa Klahan ¹＆Yuya Kumagai ¹＆Haruhide Mori ¹＆Atsuo Kimura ¹

收到：2017年3月8日/修订：2017年6月20日/接受：2017年6月21日/在线发布：2017年7月7日

＃ 德国Springer-Verlag GmbH 2017

摘要黑曲霉alpha;- 葡萄糖苷酶（ANG）是糖苷水解酶家族31的成员，在非还原端催化alpha;- 葡萄糖苷键的水解。在高浓度麦芽糖的存在下，该酶还催化通过反式葡萄糖基化作用形成alpha;- （1 → 6）- 葡萄糖基产物，并被用于生产工业上有用的乳糖和异麦芽低聚糖。在100mM存在下的初始transglucosylation由野生型ANG麦芽糖[GLC（alpha; 1 - 4）GLC]产生两个alpha; - （1 → 6） -和alpha; - （1 →4）-糖苷键，后者占转移反应产物总量的〜25％。的麦芽三糖[GLC（alpha; 1 - 4）GLC（alpha; 1 - 4）GLC]，alpha; - （1 → 4）-glucosyl productdisappearsquickly，whereasthe alpha; - （1 → 6）-glucosylproducts潘糖[GLC（alpha; 1 - 6） GLC（alpha; 1 - 4）GLC]，异麦芽糖[GLC（alpha; 1 - 6）GLC]和异麦芽三糖[GLC（alpha; 1 - 6）GLC（alpha; 1 -6）Glc]累积。为了修饰ANG的转糖基化特性，用Ala，Leu，Phe和Trp代替了Asn694残基，该残基被预测与ANG的正向亚位点形成有关。除N694A外，这些突变增强了alpha;- （1 → 4）转移反应产生麦芽三糖的初始速度，然后以与野生型ANG相似的速率降解。随着反应时间的增加，N694F和N694W突变导致大量异麦芽糖和

异麦芽三糖比用野生型酶获得的要好。在反应的最后阶段，主要产物是蔗糖（N694A和N694L）或异麦芽糖（N694F和N694W）。

关键词alpha;- 葡萄糖苷酶。转糖基化。低聚异麦芽糖。黑曲霉。结构要素。定点诱变

介绍

益生元是有益细菌（包括双歧杆菌属和乳杆菌属）选择性使用的低聚糖，并且已显示，日常饮食中摄入益生元可以改善人体健康。这些化合物转化为短链脂肪酸（例如乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐）可改善食物摄入，降低发炎活性并促进胰岛素信号传导（Hur和Lee，2015年）。益生元的主要类别是低聚果糖和低聚半乳糖。其他有益的益生元碳水化合物包括异麦芽低聚糖（IMOs），木寡糖，大​​豆寡糖，乳糖蔗糖和甘露寡糖（Kothari和Patel 2014 ）。

间海事组织，潘糖的益生元效果（PN; alpha; d -glucopyranosyl-（1 → 6） - alpha; - d -glucopyranosyl-（1 → 4） - d 吡喃葡萄糖），和其他寡糖含有alpha; - （1 → 6） -糖苷键（一个或多个）是在双歧杆菌肠道菌群（Kohmoto等数量的增加1988 ，1991 ），特别是在响应于IMO的二糖和三糖的级分（Kaneko等人。1994年）。在试验培养和结肠发酵模拟中，PN还促进双歧杆菌的显着生长（Mauml;kelauml;inen等，2009）。; Kohmoto等。1992 ）。在使用黑曲霉（ANG）的alpha;- 葡萄糖苷酶的反应中，通过alpha;- 葡萄糖苷酶催化的麦芽糖（G2）（Takaku 1988 ）实现了含alpha;- （1 → 6）-葡萄糖苷键糖的工业生产。它属于糖苷水解酶家族31（GH31）。ANG催化形成alpha;- （1 → 6）-糖苷键的能力引起对该酶的极大兴趣。

alpha;- 葡萄糖苷酶水解alpha;-在底物非还原端的糖苷键。在高底物浓度的存在下，该酶还催化转糖基化，其将葡糖基部分从供体底物转移至受体底物的OH-基团。该酶采用的双置换机制通过糖基酶中间体进行，该中间体涉及两个功能基团：催化亲核试剂和一般的酸/碱催化剂。后者将质子转移至糖苷键，随后离去基团离开底物。同时，亲核试剂攻击异头碳形成中间体。水解是由于中间体在涉及水分子的反应中分解（去糖基化）而导致的，并由一般的碱催化剂辅助活化。转葡糖基化通过相同的去糖基化步骤进行，但糖（醇）分子的OH-基团取代了水分子。在高浓度的G2下，alpha; 葡萄糖苷酶最初合成PN（图1 a）和麦芽三糖（G3）（图1 用b）alpha; - （1 → 6）和alpha; - （1 → 4）传输，分别。随着从伴随水解而得，并且在糖基化步骤释放的葡萄糖的量，所述酶异麦芽糖产生（IG2）（图1 c）和IG2可以作为进一步的受体物种充当为异麦芽三糖（IG3）生产（图1 d ）。偶尔发生转移至2-OH或3-OH部分[分别形成曲二糖（KJ）或黑糖（NR）]。

该反应的机理表明，转葡萄糖基化所需的结构元件存在于亚位点 1和/或 2处（图1 ）。由于没有可用的ANG的三维结构，我们基于同源GH31蛋白的结构，预测Asn694是正子位点的候选残基。

在这项研究中，我们构建了四个突变酶N694A / L / F / W，其水解活性表明Asn694对正亚位点的贡献。我们分析了由高浓度的G2与野生型ANG和四个Asn694变体反应产生的转糖基化产物。结果表明，在反应的初始阶段，野生型酶催化了alpha;- （1 → 4）-和alpha;- （1 → 6）糖苷键的形成。N694L / F / W改变了转糖基化的特异性，暗示Asn694是调节ANG的转糖基化产物的结构元件。

材料和方法

生产Asn694突变的ANG

Asn694的定点诱变是根据PrimeSTAR诱变基础试剂盒（Takara Bio，Shiga，Japan）的手册进行的，使用模板[带有成熟ANG cDNA 的表达载体（Tagami等人2013a ）]和引物（表1））。使用ABI PRISM 310遗传分析仪（Thermo-Applied Biosystems，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）分析所得产物的核苷酸序列。如先前所述（Tagami等人2013a ）进行突变ANG的生产和纯化。酶的纯度通过SDS-PAGE确定。分离的蛋白质的浓度通过氨基估计

图1.黑曲霉alpha;- 葡糖苷酶（ANG）催化的转葡糖基化反应，形成了聚蔗糖（PN），beta;-麦芽三糖（G3），c-异麦芽糖（IG2）和d-异麦芽三糖（IG3）。圈，葡萄糖单位；带有斜线的圆圈，还原葡萄糖单位；两个圆之间的横线，alpha;- （1 → 4）-糖苷键；两个圆之间的楔形（^），alpha;- （1 → 6）糖苷键。的- 1， 1和 2子网站被表示为- 1， 1和 2，分别。– d中的左图描绘了葡萄糖基酶中间体

表1 本研究中用于PCR的寡核苷酸序列

下划线的突变密码子

使用JLC-500 / V系统（日本东京的Nihon Denshi）对蛋白质水解产物（6 M HCl，110°C，24 h）进行酸分析，然后使用茚三酮检测系统进行分析。

使用由0.2％（w / v）G2（Nihon Shokuhin Kako，Tokyo，Japan），40 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.0），0.02％Triton X组成的标准反应混合物，在37°C下测量酶活性9分钟-100，和适当浓度的酶。将反应wasterminated bythe additionof 100 mu; 大号的2M的Tris-HCl（pH 7.0）中。使用葡萄糖C-II测试（和光纯药工业株式会社，日本大阪）对释放的葡萄糖进行定量。将一单位活性定义为在上述条件下每分钟水解1mu;molG2 的酶的量。

pH和温度对活性的影响

在标准反应条件下评估了Asn694突变体活性的最佳pH，除了Britton-Robinson缓冲液（40 mM乙酸，40 mM磷酸和40 mM硼酸；用NaOH调节的pH； pH 2.3 – 8.3）用乙酸盐缓冲液代替。酶的使用浓度如下：N694A为0.80 nM，N694L为0.51 nM，N694F为0.64 nM，N694W为0.40 nM。

为了研究pH的稳定性，将N694A（79 nM），N694L（51 nM），N694F（64 nM）或N694W（40 nM）在10倍稀释的Britton-Robinson缓冲液（pH 3.0 – 11.5）含有0.1％Triton X-100。使用McIlvaine缓冲液（0.2 M NaHPO ₄，并通过添加0.1 M柠檬酸调节pH值）评估了N694L和N694W在pH 2.3 – 3.2下的活性。在标准测定条件下测量残留活性。稳定区域定义为显示残留活性gt;原始活性90％的pH范围。

N694A（4.0 nM），N694L（2.6 nM），N694F（3.2 nM）和N694W（2.0 nM）的热稳定性分别通过将酶在含有0.1％Triton X-的20 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.0）中孵育来确定。 100在37 – 70°C下进行15分钟，然后在标准测定条件下测量残留活性。如上所述确定稳定区域。

水解和转糖基化的表征

用于测量水解速率的底物是G2，G3，麦芽四糖（G4），麦芽五糖（G5），麦芽六糖（G6），麦芽七糖（G7），KJ，NR（Wako Pure Chemical Industry），IG2和PN（Tokyo Chemical）工业，日本东京）。动力学参数k _cat 和K _m是在KaleidaGraph 3.6 J（Synergy Software，雷丁，宾夕法尼亚州，美国）中从Michaelis-Menten方程的权重对八种底物浓度（从三分之一到三倍）下的初始速度的加权拟合计算得出的K _m值。重复实验三次，计算平均值和标准偏差值。根据k _cat和K _m的平均值计算K _cat / K _m 值。酶的浓度如下：野生型ANG（1.3 – 2.9 nM），N694A（0.35 – 4.0 nM），N694L（0.73 – 5.1 nM），N694F（0.43 – 3.2 nM）和N694W（0.27 – 8.1 nM） ）。

野生型或突变的ANG 的初始转葡萄糖基化速度（v _tg）以G2为底物进行了分析。将由100 mM G2，酶（野生型，4.2 nM; N694A，3.2 nM; N694L，1.7 nM; N694F，2.6 nM; N694W，2.0 nM）和40 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.0）组成的反应混合物在90°C下温育。 37℃。2、4、8、12和15分钟后，通过在100°C下加热3分钟来终止反应。葡萄糖，G2，G3，PN和葡萄糖的浓度[CT; 2,4-二-O-（alpha;-葡萄糖基]-葡萄糖]使用C

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