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固定化表达毕赤酵母GS115中alpha;-氨基酸酯酰基转移酶生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
1.摘要
背景：L-丙氨酸-L-谷氨酸由于其独特的物理化学性质，在临床上具有很大的应用潜力。作者克服了传统化学合成的缺点，提出了一种利用重组大肠杆菌OPA合成Ala-Gln的新方法。虽然用重组大肠杆菌OPA得到了满意的结果，但内毒素和多种抗生素的使用以及毒性诱导剂给Ala-Gln的临床应用带来了潜在的生物安全危害。
结果：本研究采用较安全的宿主毕赤酵母作为大肠杆菌的替代物。构建了重组巴斯德毕赤酵母（名为GPA），其具有来源于SY1的alpha;-氨基酸酯酰基转移酶（SsAet）原始基因，可用于生产Ala-Gln。为了提高SsAet在毕赤酵母中的表达效率，对其进行密码子优化后获得菌株GPAp。本文中，GPAp的Ala-Gln产量约为GPA的2.5倍。最佳诱导条件（26℃培养3天，每天添加1.5%的甲醇），最佳反应条件（28℃和pH8.5），合适的底物条件为Ala OMe/Gln=1.5/1。虽然大多数金属离子对反应结果没有影响，但催化活性在Fe3 的存在下，GPAp催化活性略有下降。当加入半胱氨酸或PMSF时催化活性则明显增加。在最佳条件下，GPAp产生的Ala-Gln最大摩尔收率为63.5%，琼脂包埋对GPAp的催化活性在10次循环后保持极稳定。
结论：以经济性、高效性和实用性为特征，通过回收固定化GPAp（全细胞生物催化剂）生产Ala-Gln是一种绿色、有前途的工业方法。
关键词：L-丙氨酸-L-谷氨酸，alpha;-氨基酸酯酰基转移酶，固定化，密码子，回收利用
作为体内氮的主要载体，L-谷氨酰胺（Gln）是血浆中最丰富的游离型氨基酸[1]，是一种条件必需氨基酸[2,3]。 也就是说，在剧烈运动、损伤和感染等特定条件下，Gln需要外部补充剂来满足身体的需要[4]。 然而，游离Gln的广泛临床应用由于其不利的物理化学性质[5-7]而受到限制。
通过与其他氨基酸结合而含有谷氨酰胺的二肽[8]是克服Gln内在局限性的一种有效方法。在临床实践中，L-丙氨酸-L-谷氨酸（Ala-Gln）和甘氨酸-L-谷氨酰胺（Gly-Gln）是含有谷氨酰胺的两种主要类型[9]。临床上选择Ala-Gln作为最合适的替代品，因为它在热灭菌下具有较高的热稳定性、高溶解度（568g/L）和较高的分解率[10,11]。此外，Ala-Gln在肠外给药后将迅速从血浆中去除，而不在组织中积累，在尿液中无法检测到[12]。这些特性表明，Ala-Gln作为一种合适的普通肠内营养，在临床上将成为必不可少的。患者术后及术后恢复[13-15]，如葡萄糖溶液或生理盐水。
一般来说，Ala-Gln的工业生产采用了化学方法。然而，这些化学合成途径有明显的缺点[16-17]。这些缺点可能会增加生产成本，违反21世纪绿色化学的要求。与传统的化学合成相比，微生物酶法合成具有操作简单、原料便宜、转化效率高、工艺环保、可进一步工业化应用等优点，具有最广泛的优点[18]。最近，Abe等人[19]发现了一种名为alpha;-氨基酸酯酰基转移酶（SsAet）的新型酶，可以使用L-丙氨酸甲酯盐酸盐（AlaOme）和Gln获得Ala-Gln。在大肠杆菌菌株中构建了SsAet的异源表达体系，在40min内，Ala-Gln收率/摩尔收率分别为69.7g/L和67%[20]。 在我们以前的研究中，来源于SY1的优化后的大肠杆菌菌株OPA，获得了最高的Ala-Gln产量，最大摩尔产量为94.7%，生产率为1.89g/L/min。此外，OPA可保持快速反应速率（~10min）、较高的Ala-Gln产率和酶稳定性。
值得注意的是，产品的生物安全是至关重要的，不能忽视在食品，医疗保健和医疗电影。 虽然用重组大肠杆菌OPA得到了满意的结果，但内毒素和多种抗生素的使用以及毒性诱导剂（IPT G）给Ala-Gln的重要应用带来了潜在的生物安全危害。在这里，我们使用了更安全的宿主毕赤酵母来生产Ala-Gln，这是2008年添加到欧洲食品安全局（EFSA）的合格安全推定（QPS）清单[21]。在不添加抗生素的情况下，通过整合表达异源基因进一步提高了安全性，在Ala-Gln的纯化过程中，诱导剂甲醇很容易被蒸发去除。首先通过密码子优化来提高来源于细菌的SsAet在毕赤酵母中的表达效率。为了获得更高的催化活性，对培养和反应条件的优化进行了研究。在此基础上，通过琼脂包埋和循环固定化，进一步提高了催化稳定性和生产效率。因此，通过原核表达系统毕赤酵母GS115过表达SsAet，为进一步开展Ala-Gln的工业化无污染生产奠定了良好的基础。
2.材料和方法
2.1菌株和媒介
本研究中使用的菌株和质粒见表1。对于常规使用，在LB培养基（0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨和1%氯化钠）中，根据需要使用添加相应的抗生素或酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖）中进行菌落培养，可暂存于4℃保存。若需长期储存，培养物需保存于20%甘油中置于-80℃。需要制备几种不同的培养基来选择和培养菌株毕赤酵母GS115的转化子。如下：RDB培养基（1M山梨醇，2%葡萄糖，1.34%YNB，4*10-5生物素、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸各占0.005%，和2%琼脂）进行筛选His 转化子，最小葡萄糖（MD）/最小甲醇（MM）培养基（1.34%YNB，4*10-5生物素、2%琼脂和2%葡萄糖或0.5%甲醇）选择突变体的Mut 或Mut-甲醇利用型，缓冲甘油复合物（BMGY）/缓冲甲醇复合物（BMMY）培养基（1.34%YNB，1%酵母膏，2%蛋白胨，4*10-5生物素，0.1M磷酸钾和1%甘油或0.5%甲醇），用于重组菌株的生长诱导在毕赤酵母表达试剂盒[22-25]手册的基础上进行制备。
2.2构建表达载体
用正向引物SsAET-F（ECORI限制位点下划线）和反向引物SsAET-R（NotI限制位点下划线）对SY1的SsAET基因进行PCR扩增，如表2所示。用限制性酶（EcoRI和NotI）酶切SsAET基因和pPIC9载体，组装表达载体pPIC9-SsAET并在含氨苄抗性的大肠杆菌DH5alpha;中表达。同时，从Sangon（中国上海）获得了pUC57-SsAETp载体，该载体携带参考毕赤酵母密码子优化原则的基因SsAETp。然后，用相同的限制性内切酶（EcoRI和NotI）从载体pUC57-SsAETp中获得SsAETp基因。如上所述，表达载体pPPIC9-SsAETp并在含氨苄抗性的大肠杆菌DH5alpha;中表达，后经酶切和DNA测序进行确定
2.3 转化及目的克隆的筛选
从DH5alpha;-pPIC9SsAET中分离出的整合转化子pPIC9-SsAET，用限制性酶BGLII线性化，遵循Invitrogen的实验规范将质粒转化毕赤酵母GS115中。His MutS转化体的选择有三种形式：（1）His 表型选择。RDB培养基选择性地允许pPIC9-SsAET的整合BglII线性化的再复合菌株的生长，并被用于实现HIS 表型的选择；（2）MutS表型基于His 表型的筛选。MutS表型很少代谢甲醇作为唯一的碳源，因为AOX1基因的破坏，这可以MD/MM琼脂平板上进行选择的不同的生长行为；（3）His MutS转化子用AOX1启动子上游120bp衍生的正向引物GS115-F，反向引物GPA-R/GPAp-R进行PCR分析确定。DNA测序后使用AOX1-F和AOX1-R， His MutS转化子命名为GS115-pPIC9SSAET（GPA）。同样，带有经密码子优化后的SsAETp基因的质粒GS115-pPIC9SsAETP（GPAp），其中也是按照上面的方式构建的。所有涉及的引物在表2中从5rsquo;到3rsquo;方向列出。
2.4靶蛋白的表达和诱导条件的优化
毕赤酵母转化子（GPA或GPAp）用25mL BMGY培养基在250mL摇瓶中30℃，220 rpm
条件下培养16-18h。然后，通过离心收集细胞并重新悬浮到初始OD600=1.0在100 ml BMMY新鲜培养基/500ml摇瓶中，在30℃，250 rpm条件下培养。每24h添加甲醇作为诱导剂，至最终浓度1.0%（v/v），持续120h（5天）。
为了进一步提高表达水平，优化了不同的诱导条件，包括诱导温度（18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃，和30℃），最终浓度的诱导剂（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%），诱导时间（2天，3天，4天、5天和6天）。
2.5 Ala-Gln生产试验
Gln、AlaOMe和Ala-Gln是从San-gon和阿拉丁工业公司购买的。以GPA或GPAp为全细胞生物催化剂的Ala-Gln生产如下：底物（100mM AlaOme和100mM Gln）在诱导后直接加入到100mL培养物中，同时用6M NaOH控制pH在8.5。将酶催化反应维持在24℃ 10min，然后依次离心（10000g，2min）和热失活（100℃，5min）。所有样品暂时存放在4℃，用于高性能液体色度学（HPLC）分析。
2.6酶催化反应的优化
研究了最佳催化反应条件。反应温度分别为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃和30℃，分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5。此外，还选择了不同类型的氨基酸酯作为底物，以增加Ala-Gln的产量，如盐酸l-丙氨酸甲酯、盐酸l-丙氨酸乙酯、盐酸l-丙氨酸异丙酯、盐酸l-丙氨酸叔丁酯和盐酸l-丙氨酸苄酯。此外，最大摩尔产量的比值分别为1/1、1/1.5、1/2、1.5/1和2/1，以达到不同实验组。在本研究中，不同的底物浓度（AlaOMe-Gln=150-100，300-200，450-300，600-400，900-600 mM）与AlaOme/Gln=1.5/1的比例相同的。然而，为了进一步提高酶活性，添加了不同的金属离子（Na ，Ca2 ，Mg2 ，Zn2 ，Fe2 ，以及Fe3 ）以及活化剂（半胱氨酸）和蛋白酶抑制剂（EDTA和PMSF）进行了研究，其最终浓度为10mM。
2.7 Ala-Gln的HPLC分析
利用C18柱(ODS-3，4.6*250毫米，5mu;m ；GLSciences公司，日本)，用HPLC检测 GPA、GPAP和Ala-Gln形成的SSAet的活性。前面描述了一种详细的方[20]。
2.8 GPAp的催化稳定性，固定化和可重用性
研究了GPAp对SsAet的催化稳定性从两个方面。将其中一个储存在7.2的中等pH下4°C持续5天。其他存储在最佳状态相同的反应pH和温度（8.5和28°C）时间（5天）。不同时间点的活动分别是检测方法如上所述。
为了促进进一步工业化的可能性，固定GPAp细胞。特离心收集细胞沉淀并重悬于10mL磷酸盐缓冲液中。预备细胞沉淀立即与10mL4％（w/v）琼脂混合
在55°C水浴中保温的溶液[25，26]。十种混合物缓慢滴入冰中水-油不混溶溶剂，形成均匀的球形珠（直径约3-4毫米）。琼脂珠洗涤并与磷酸盐缓冲液在4°C下储存用于回收测试。在这项研究中，在同一反应下进行了10个催化反应循环评估条件的可重用性固定的细胞。
3.结果和讨论
根据我们先前的研究[20]，我们来自泗阳链球菌的SsAET基因的完整核苷酸序列SY1与西阳沙门氏菌的SsAET有98％的同一性AJ2458（GenBank：AB610978.1）。相应地，SsAet酶含有619个氨基酸，估计分子量约为71.03 kDa。与AJ2458的SsAet相比，三个突变在独特的酶SsAet中发现了氨基酸SY1，可能会导致意外更改的结构和改进的酶催化作用活动[27，28]。
异源宿主中的靶蛋白往往由于密码子偏倚而难以正常发挥作用[29].有61个核苷酸三重态（密码子）编码20个氨基酸，但不同物种同义密码子的选择有很强的偏差[30]。原核生物和P之间有相当大的差异（60%）。巴斯德密码子偏差是非常明显的，如附加文件1：图S1所示。为了解决潜在的问题，提高表达效率，密码子优化被认为是一个合理的选择。为此，对18
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