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金钗石斛与多种细菌共培养促进种子发芽
Elena A. Tsavkelova1 bull; Maria A. Egorova1 bull; Maria R. Leontieva1 bull;
索菲（Sophie G. Malakho）2bull;加琳娜·L。Kolomeitseva3bull;亚历山大·内托罗夫（Alexander I. Netrusov）1
收到：2015年9月23日/接受：2016年2月8日/在线发布：2016年2月11日
copy;施普林格科学 商业媒体Dordrecht 2016
摘要 由于兰花具有很强的生物关系和很小的种子，因此需要养护菌根才能发芽，从而养护兰花具有挑战性。当热带植物在温室的人工条件下生长时，这种情况会加剧。我们旨在选择促进植物生长的根际细菌（PGPR）进行兰花种子发芽，研究植物与微生物之间的相互作用，并确定两种石斛在选择细菌伴侣时是否存在特异性。通过从杓唇石斛根分离根瘤菌和内生根瘤菌，测试了已知的PGPR（偶氮螺旋菌，肠杆菌，链霉菌）和较少流行的菌株（Roseomonas，Agrococcus）的生物活性生长素的产生。用另一种新选择的菌株和先前分离的菌株（分枝杆菌属，短小芽孢杆菌）对另一种兰花金钗石斛进行细菌化处理后发现，兰花在与有益细菌的关系中没有表达明显的特异性，但拒绝与链霉菌和偶氮螺旋菌建立联系。内生农杆菌和鞘氨醇单胞菌
DOI 10.1007/s10725-016-0155-1
原始纸
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amp; Elena A. Tsavkelova tsavkelova@mail.ru
1 Department of Microbiology, Biological Faculty, Lomonosov Moscow State University, 1-12 Leninrsquo;s Hills, Moscow, Russia 119234
2 Department of Biotechnology, Biological Faculty, Lomonosov Moscow State University, 1-12 Leninrsquo;s Hills, Moscow, Russia 119234
3 The Stock Greenhouse of the The Tsitsin Main Botanical Garden RAS, Botanicheskaya Street 4, Moscow,
Russia 127276
菌株极大地促进了兰花的发芽。结核分枝杆菌和短小芽孢杆菌也分别在其正面影响稳定的金钗石斛种子的加速发展。在电子显微镜下可以观察到伴生细菌对种子表面和内部组织的主动定植。我们对兰花与细菌的关系进行了分析。总体而言，数据为选择兰花种子杀菌的有效菌株提供了一个很好的策略。因为并非所有已知的PGPR都能在建立与兰花种子的关联框架中发挥作用并取得成功。菌株的稳定活性保证了它们在兰花体外生物技术中的长期有效应用。
关键词 兰花相关根瘤菌·内生菌·兰花种子菌种·生长素产生·扫描电子显微镜
引言
石斛属是兰科菊科植物的最大的属之一。尽管兰花种子每一个种子囊产生成千上万的种子，它们 在种子植物中按尺寸（0.05–6毫米）或重量最小（0.31–24 lg） (Roberts and Dixon 2008)，它们没有胚乳，只与适当的真菌共生而消亡(Smith and Read 2008)。一种共生的体外兰花萌发需要复杂的营养培养基，并补充各种物质，维生素和植物生长刺激(Teixeira da Silva et al. 2015)。寄主植物与植物促生根瘤菌（PGPR）之间的稳定关系取决于氮固定，抗菌剂和植物生长调节剂的产生，矿物质的增溶以及降低细菌数量等细菌活性。
乙烯水平升高或植物抗逆性增强多种非生物胁迫条件 (Ryan et al. 2008; Saharan and Nehra 2011;Ahemad and Kibret 2014; Passari et al. 2015)。目前已经报道了许多能够在不同细菌种类中产生生长素的PGPR (Khalid et al. 2004; Tsavkelova et al. 2006; Spaepen et al. 2007; Ryan et al. 2008; Ahemad and Kibret 2014; Habibi et al. 2014)。
以前，我们发现了在几个附生和陆生温室和野生兰花的气生根和基质根定居的细菌群落的差异(Tsavkelova et al. 2004, 2007a; reviewed in Teixeira da Silva et al. 2015)。 Knudson (1922)首次提到兰花与细菌的相互作用。Wilkinson et al. (1989, 1994)表明，与假单胞菌和芽孢杆菌菌株共同接种的菌根真菌促进了陆生翼节藻种子的萌发。我们发现可以在附生兰花的根部形成由真菌，异养细菌和蓝细菌组成的微生物群落，以及纯细菌培养物来促进兰花种子萌发的能力(Tsavkelova et al. 2007b).。
如今，由于对热带(Galdiano Juacute;nior et al. 2011; Faria et al. 2013; Yang et al. 2014)和温带地区 (Shekhovtsova et al. 2013）的兰花相关细菌的研究，人们对该主题的兴趣日益浓厚。Faria et al. (2013)发现几种Paenibacillus菌株都促进了Cattleya loddigesii Lindl幼苗的生长。芽孢杆菌属和肠杆菌属的菌株提高了Cattleya walkeriana Gardn的驯化和幼苗存活 (Galdiano Junior et al. 2011)。.尽管上述研究描述了已经发芽的小苗的处理方法，但我们着眼于根际细菌在种子发芽的第一阶段中的作用。关于成功应用各种有益微生物菌株促进不同农作物生长的大量数据 (e.g. reviewed in Tsavkelova et al. 2006; Ahemad and Kibret 2014)。但是，兰花生物学的特异性限制了兰花微生物生物技术中可能使用的PGPR菌株的数量。此外，兰花种子的发芽是一个长期过程，需要选择策略来选择最佳菌种和菌株。
在这项研究中，我们的目的是研究两个石斛物种之间在选择细菌伴侣时，在几个以前的(Tsavkelova et al. 2007b)和新的（内生的）分离菌株中是否存在特异性。从杓唇石斛的根中分离的细菌(Buch.–Ham.)Swartz被用于另一种石斛金钗石斛的种子杀菌。与寻找可能很少使用的PGPR一起，我们旨在测试通常被识别为PGPR的菌株
作物植物，因为它们具有兰花种子萌发的能力。为了检验兰花相关细菌对种子发育加速的直接影响，我们分析了在补充不同来源的外源色氨酸作为微生物生长素生物合成潜在诱导剂的条件下生产吲哚-3-乙酸的菌株。我们还想证明所选菌株在兰花长期发芽中的稳定性，从而保护植物。为了估计有益细菌是否建立了内生生活方式，通过电子显微镜检查了它们与种子和新生芽相互作用时它们的优选定位。
实验材料和方法
根的采样和兰花相关细菌的分离
为了选择适用于兰花种子杀菌技术的细菌，我们使用微生物培养物。为此，还通过使用单菌落分离的标准方法分离了所有研究的菌株。分枝杆菌和芽孢杆菌先前分离出的化合物对促进毛白僵菌种子萌发具有积极作用(Kolomeitseva et al. 2002; Tsavkelova et al. 2004)。我们想知道从一个石斛中选出的细菌培养物是否对另一种石斛有效。两种植物都保存在主要植物园（莫斯科）的家畜温室中，并作为盆栽植物种植。在取样当天分离细菌。为了分离根际细菌，将根皮从松树皮上清除，用无菌自来水中冲洗，在磷酸盐缓冲液中用杵研磨，以制备初始悬浮液和10倍稀释液(Tsavkelova et al. 2007a)；将等分的0.1ml平板接种于制霉菌素（50 mg ml-1）的两种选择性培养基上，以防止真菌生长。使用补充了酵母提取物的胰蛋白酶大豆琼脂(Oxoid, UK)和改良的Czapek琼脂。为了分离内生细菌，通过在10％的家用漂白剂中浸泡5分钟来对根进行灭菌，然后在蒸馏水中进行三次冲洗。在28°C下孵育，直至检测到单个菌落后，分离出每个不同的菌落。根据菌落特征的不同，例如大小，颜色，形状，质地，稠度和粘液形成，总共采集了100株菌株进行培养。
菌株鉴定
我们对细菌培养物进行了生长素生物合成测试（见下文），并等所检查的营养培养基上产生了足够的生物量后，
根据细胞的形态，革兰氏反应，氧化酶和过氧化氢酶活性的存在，菌丝体（放线菌）和孢子形成等常规形态学和生化特征进行了初步分析。对显示IAA活性的产生的培养物进行了双链16S rRNA基因序列的分析。为了这个目的，将冷冻干燥的细菌生物质用Mini-BeadBeater-8匀浆(BioSpec Products, USA)。DNA提取是通过标准的苯酚-氯仿程序进行的。使用Sintol（俄罗斯莫斯科）设计的引物试剂和“ Biometra Tpersonal”热循环仪（德国）进行16S rRNA的PCR扩增。使用了两对引物：第一条扩增几乎全长的16S核糖体DNA（rDNA）B63f (50-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3)和B1387r (5-GGGCGGWGT GTA CAA GGC-30)(Marchesi et al. 1998)，和部分长度的UNIV 515F (50-GTGBCAGCMGCCGCGGTAA-30, Kublanov et al. 2009)和BACT 907R (50-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-30, Muyzer et al. 1998)。 纯化的基因组DNA在PCR反应中用作模板。DNA扩增在25 ll混合物中进行，使用10 ng基因组DNA，PCR缓冲液，2.5 mM MgCl2，0.2 lM每种引物，0.25 mM dNTP和0.06 U ll-1Taq聚合酶(Sintol, Russia)。PCR条件如下：1个循环，在94℃下3分钟；在90°C下20 s，55°C下30 s和72°C下1 min的30个循环;最后在72°C下伸长4分钟。在带有TAE 19缓冲液的1％琼脂糖凝胶中于80 V电泳30分钟，对2-4升PCR产物进行电泳分析。DNA GeneRulerTm值1 Kb DNA阶梯(MassRuler DNA Ladder Mix, Thermo scientific, Germany)被用作对照。使用Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter）纯化16S rRNA基因的扩增片段，并使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒（Applied Biosystems）在ABI 3730自动DNA测序仪上测序。执行制造商推荐的标准程序，并使用上述引物。用软件Lasergene（DNASTAR）和VectorNTI（In-vitrogen）对16S rRNA基因的序列进行分析。对于比较分析和同源序列，请搜索NCBI（国家生物技术信息中心网站；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）和核糖体数据库项目（RDP，http://rdp.cme.msu.edu）的数据库。
细菌生长素的生产和比色法测定吲哚-3-乙酸
为了估算外源色氨酸影响的差异，我们分别在
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