利用橙皮脂芽孢杆菌α-半乳糖苷酶从半乳糖和甘油中生产异红糖苷外文翻译资料

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酶与微生物技术134 (2020)109480

酶与微生物技术

利用橙皮脂芽孢杆菌alpha;-半乳糖苷酶从半乳糖和甘油中生产异红糖苷

王磊^a,1,*, Liya歌^b,1, Xiaoxian他^a,c范,腾^a,c、美容、胡^a,*,勇道^a

一个

中国科学院微生物研究所中国科学院微生物生理与代谢工程重点实验室，北京100101 ^b 2 .北京工商大学中国轻工化妆品实验室，北京102488

^c 2 .中国科学院大学，北京100190

关键词:

半乳糖基甘油异红糖苷alpha;-半乳糖苷酶反水解全细胞生物催化剂

A B S T R C T

异红藻糖苷(D-isofloridoside和L-isofloridoside)是红藻主要的光合产物。在此，考虑到异红糖苷的重要性，我们开发了一种潜在的有效方法，利用含有alpha;-半乳糖苷酶的全细胞生物催化剂从半乳糖和甘油中生产异红糖苷。从hesperidum、Lactobacillus plantarum和Bifidobacterium青春期双歧杆菌中克隆alpha;-半乳糖苷酶基因，并在大肠杆菌中过量生产。以异红糖苷为原料，采用alpha;-半乳糖苷酶(AHGLA)合成异红糖苷。考察了pH、温度和底物浓度对反应的影响。在最佳的生物转化条件下，最终异红糖苷浓度达到0.45 M(半乳糖转化率23%)。用活性炭和煅烧硅石对反应产物进行纯化，经液相色谱-质谱和核磁共振鉴定为D-和l -异红糖苷的混合物。本研究为低成本甘油和半乳糖生物合成异红糖苷提供了一种可行的方法。

1.介绍

半乳糖酰甘油是一种醇溶性半乳糖苷，由D-半乳糖酰和甘油组成，存在于许多红藻和海藻Irideae zuminarioides[1]中。alpha;- d -半乳糖-甘油和beta;-D-半乳糖-甘油广泛应用于化妆品、保健品、食品和药品中[2,3]。alpha;- d -半乳糖基-甘油是红藻主要的光合产物，从红藻穿孔紫菜[4]中提取。一般来说，alpha;- d -半乳糖基-甘油有两种对映体形式:红葡萄糖苷(2-O-alpha;- d -半乳糖基-甘氨酸- cerol)和异红葡萄糖苷(1-O-alpha;- d -半乳糖基-甘油)[5]。红藻糖苷被认为是红藻主要的光合储备产物，参与了细胞[6]的渗透驯化。低质量的海苔(退色海苔)含有大量的地坪皂苷。研究表明，红葡萄糖苷在体外具有益生元特性，并在大鼠中评估了红葡萄糖苷的益生元活性[7,8]。异红糖苷有两种异构体形式:d -异红糖苷(1-O-alpha;- d - galactopyranoyl - d -甘油)和l-异红糖苷(1-O-alpha;- d - galactopyranoyl - l-甘油)。通过高效液相色谱-串联色谱法，证实了红藻(沟藻和海藤)含有高浓度的异红糖苷

质谱分析(HPLC-MS)[9,10]。利用高效液相色谱法(NH₂ 粗提物[11]经过连续的纯化。然而，据我们所知，目前还没有合成异红糖苷的化学方法。

alpha;-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22, GLA)催化去除alpha;-半乳糖苷[12]的末端alpha;-1,6链非还原半乳糖残基。GLA广泛分布于微生物、哺乳动物和植物中，被分为糖苷水解酶家族4,27、36、57、97和110[13,14]。GLA已在食品、饲料、生物医药和糖业等多种生物技术应用中得到广泛应用。已有研究表明，GLA可以水解alpha;- d -半乳糖-甘油，生成等摩尔量的d -半乳糖和甘油[16]。一些GLAs除了具有水解活性外，在高底物浓度下还具有转糖基化活性，可合成alpha;-半乳糖-谷糖[17,18]。

在之前的报道中，beta;-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)催化半乳糖和甘油[19]反水解合成beta;- d -半乳糖-甘油。在本研究中，描述了一种潜在的有效的方法，通过催化半乳糖和甘油的反水解来合成异红糖苷(图1)

https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2019.109480

2019年6月13日收到;2019年11月20日收到修订表格;2019年11月26日

0141-0229/copy;2019爱思唯尔保留所有权利。

酶与微生物技术134 (2020)109480

王莉，等。

图1所示。alpha;-半乳糖苷酶(GLA)催化反水解生产半乳糖和甘油异红糖苷。

以hesperidum脂芽孢杆菌(AHGLA)为原料，研究了反应pH、温度和底物浓度对异氟苷产率的影响。最后，一个含有AHGLA的全细胞生物催化剂在1-L生物反应器中在12小时内产生0.45 M异红化糖苷。由于水解和水解的可逆平衡，最终半乳糖转化率仅为23%。然而，半乳糖和甘油是低成本且容易获得的底物;本研究为异红皂荚苷的工业化生产提供了一种经济可行的方法。

2.材料和方法

2.1。材料

已收到商业试剂，包括T4 DNA连接酶、Gibson试剂盒(New England Biolabs)、DNA聚合酶(2times;高保真Master Mix, TSINGKE)、质粒提取和凝胶纯化试剂盒(Omega)、活性炭Norit (type Norit SX ultra)、煅烧Celite 501 (Steinheim)。媒体元件购自Becton Dickinson(北京，中国)。甘油、半乳糖和其他化学药品均购自Sigma-Aldrich (Steinheim，德国)。

2.2。含GLA的全电池催化剂

本研究所用菌株及质粒均列于表1。植物乳杆菌GLA (LPGLA)、青春期双歧杆菌GLA (BAGLA)和AHGLA编码基因以大肠杆菌的密码子偏好为基础进行密码子优化，由安徽通用生物系统有限公司合成。引物见表S1

表1

本研究中使用的菌株和质粒。

密码子优化后的序列列在补充材料(序列S1、S2、S3)中。PCR产物用[20]Gibson组装法插入载体pyb1(来源于pBAD/HisB载体)。分别将pYB1s-LPGLA、pYB1s-BAGLA和pYB1s-AHGLA导入大肠杆菌BW25113中。细胞在37°C 220 rpm的摇瓶中培养，培养基为luri - bertani (1% tryptone, 0.5%酵母提取物，1% NaCl)或ZYM自诱导培养基(1% tryptone, 0.5%酵母提取物，25 mM Na)₂HPO₄， 25毫米KH₂阿宝₄， 50毫米NH₄Cl, 5mm Na₂所以₄， 2毫米MgSO₄如:0.5%的甘油、0.05%的葡萄糖、0.2%的乳糖和微量金属)。ZYM微量金属(1000times;)含有50毫米FeCl₃， 20毫米碳酸钙₂， MnCl各10毫米₂ 和ZnSO₄和每个2毫米的CoCl₂, CuCl₂, NiCl₂,Na₂MoO₄,Na₂搜索引擎优化₃,和H₃薄₃ [21]。必要时加入50 mu;g/mL链霉素。为了表达重组蛋白，将隔夜培养的细胞接种于ZYM自诱导培养基(1%接种物)中，30°C持续振荡16h，离心收集细胞用于后续实验。

2.3。Isofloridoside生产

为了制作异红苷，在ZYM中自诱导16小时后，于6000times;g离心5min，调整OD值_{600 nm} = 30，重悬于含有100 mM乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 5.5)、0.4 M半乳糖和2 M甘油的10.0 mL反应混合物中。生物转化反应在37°C, 200转的摇床上进行12小时。

2.4。反应参数的优化

对反应参数进行了优化。诱导后收集含有AHGLA的全细胞生物催化剂，调整OD值_{600 nm} = 30，在含有半乳糖(0.4 M)、甘油(0.4 M)和醋酸盐/磷酸盐缓冲液(pH 4.0-7.0)的反应混合物中重悬。全细胞生物转化于37°C孵育1 h，然后使用Agilent 1260高效液相色谱系统分析反应成分浓度。考察pH值、乙酸钠/乙酸缓冲液(pH 4.0-5.5)和钠对反应的影响₂HPO₄/不₂阿宝₄ (pH值6.0-7.0)。为了考察反应温度的影响，在25-60°C进行反应。为了评价底物浓度对异红糖苷产率的影响，考察了半乳糖和甘油的摩尔比。首先，将甘油浓度设置为2.0 M，将半乳糖浓度从0.4 M增加到2.0 M;半乳糖浓度保持在2.0 M时，甘油浓度从1.0 M增加到3.0 M。

2.5。净化isofloridoside

反应混合物(10 mL)用去离子稀释至100 mL

2

王莉，等。

加入15克活性炭搅拌1小时。吸附在活性炭上的产物在100 mL 50:50的水/乙醇溶液中搅拌1 h提取。将水/乙醇溶液在50°C真空下聚集浓缩，得到异红糖苷和半乳糖[22]的混合物。混合物装入xk10 /20柱;柱料(300 mL)由活性炭Norit和煅烧的Celite 501 1:1混合物组成。采用2.5%乙醇/水(2 L)、5%乙醇/水(1 L)、20%乙醇/水(1 L)三步洗脱，20%乙醇萃取，50℃真空浓缩得到产物[23]。对纯化产物进行了HPLC、LC-MS和核磁共振(NMR)分析和表征。

2.6。分析方法

采用Agilent 1260高效液相色谱系统，配以5 mM H的Bio-Rad Aminex HPX-87H柱，分析反应混合物的浓度₂所以₄ 作为移动相位和折射率探测器。保持柱温为40℃，流速为0.5 mL/min。HPLC分析表明，该方法能有效分离甘油、半乳糖和D/ l -异红苷。用LC-MS测定纯化化合物的分子质量。使用带有电喷雾电离源的TSQ量子存取MAX质谱仪记录光谱。在500兆赫(¹H)或129mhz (¹³使用D C)₂O作为溶剂。

3.结果与讨论

3.1。酶的选择

为了实现异红糖苷的生产，需要一种高效的催化半乳糖和

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