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通过仿生矿化在无机杂化纳米花中固定嗜热脂酶
Yong Liu a , Xinxin Shao a , Deqiang Kong a , Guangquan Li b,*, Quanshun Li a, *
a Key Laboratory for Molecular Enzymology and Engineering of Ministry of Education, School of Life Sciences, Jilin University, Changchun 130012, China
b Jilin Provincial Key Laboratory on Molecular and Chemical Genetics, The Second Hospital of Jilin University, Changchun 130012, China
摘要：通过仿生矿化成功地将产碱菌中的嗜热脂肪酶QLM固定在Cu3(PO4)2无机杂化纳米花中。对固定化酶的形态、结构和元素组成进行了系统的表征以阐明酶分子的成功负载。通过对4-硝基苯基辛酸酯水解的监测，确定了固定化酶的最适温度(65℃)和pH值(8.0)。此外，与游离酶相比，由于纳米花壳的保护作用，无机杂化纳米花固定化酶对热、pH和金属离子的稳定性增强。此外，固定化酶具有良好的重复使用性和长期贮存稳定性，但重复使用8个周期或室温下在水中贮存4周后活性略有下降。总的来说，无机杂化纳米花为具有良好活性、稳定性和可重复使用性的酶的固定化提供了一种简便易行的方法，因此，该策略在开发未来生物催化应用的理想催化剂方面显示出巨大的潜力。
关键词：嗜热脂肪酶 固定化 无机杂化纳米花 仿生矿化
1.引言
酶介导的生物催化已成为一种绿色可持续技术，它可以减少工业过程中有毒有害物质的产生[1,2]。脂肪酶是一类具有催化酯化、酯交换和酯水解等多种反应能力的酶，具有催化活性高、底物范围宽、区域选择性和对映选择性好等特点[3]。因此，它们被广泛用作生物技术领域的多功能生物催化剂，包括食品生产、洗涤剂配方、化妆品和药品[4-6]。特别是，来自嗜热菌的嗜热脂肪酶在高温以及有机溶剂和洗涤剂的存在下表现出强大的催化活性和稳定性[7-9]。例如，产碱菌中的嗜热脂肪酶QLM，它的最适温度为60-70℃，在酸性或碱性环境苛刻的反应条件下具有优异的催化活性和稳定性[10-12]。然而，由于生物大分子的固有特性，酶不能很好地满足工业生物催化的活性保持、长期贮存稳定性和高效重复利用的要求。为了解决这个问题，酶在一系列纳米材料上的固定化已经成功实现，如SiO2微粒、天然衍生生物聚合物、磁性纳米微粒、SnO2空心纳米管和金属-有机框架[13-19]。所有这些固定化酶都表明，固定化酶是一种很有前途的策略，可以提高酶的稳定性和重复使用效率以及催化反应的性能[20,21]。
在酶的固定化中，一类被称为无机杂化纳米花的花状纳米颗粒由于其大的表面积/体积比、简便的合成方法和优越的稳定性而受到广泛关注[22,23]。Ge等人曾经提出了一种构建蛋白质-无机杂化纳米花的新方法，这种纳米花是由Cu3(PO4)2和酶分子以仿生矿化的方式制备的[24]。在固定化过程中，组氨酸等氨基酸可以与Cu(I)形成纳米复合物，然后Cu3(PO4)2晶体在这些Cu2 结合位点发生成核和生长，形成单独的花瓣，从而促进纳米花的形成。由于该方法模拟了自然生物系统中的自组装过程，为生物大分子封装在无机材料的保护性结构中提供了一种通用的方法，显示出酶的高负载和高效构象维持的独特特性。受此启发，人们成功制备了多种酶-无机杂化纳米花，以提高酶在生物催化过程中的活性和稳定性，可应用于葡萄糖的检测、染料的降解、脂肪酸的环氧化和木质纤维素的生产等领域[25-36]。此外，酶浓度、金属离子和培养时间对固定化酶的粒径、载酶量和活性有重要影响，在制备酶-无机杂化纳米花的过程中需要对其进行系统优化。此前，我们利用仿生矿化技术在无机杂化纳米花中实现了猪胰脂肪酶的包封，固定化酶在生物柴油生产中具有更好的催化活性、稳定性和可重复使用性[37]。在此，通过仿生矿化将嗜热脂肪酶QLM包埋在无机杂化纳米花中，得到固定化酶QLM@纳米花成功地将嗜热脂肪酶的固有稳定性与酶固定化对其稳定性的进一步提高有机地结合起来，构建了理想的、稳定的脂肪酶多功能生物催化剂。
在此，通过仿生矿化将嗜热脂肪酶QLM包埋在无机杂化纳米花中，得到固定化酶QLM@纳米花成功地将嗜热脂肪酶的固有稳定性与酶固定化对其稳定性的进一步提高有机地结合起来，构建了理想的、稳定的脂肪酶多功能生物催化剂。QLM@纳米花的酶负载量、催化性能、热稳定性、pH稳定性、可重复使用性和长期贮存稳定性以对硝基苯辛酸盐（p-NPC）水解和葵花籽油与甲醇酯交换制备生物柴油为模型，进行了系统的研究。
2.实验材料与方法
2.1 实验材料
嗜热脂肪酶QLM购自日本东京美藤三洋株式会社。异硫氰酸荧光素（FITC）和p-NPC在Sigma-Aldrich中订购。向日葵油从威盛公司（中国江苏）购买，未经进一步纯化就使用。所有其他化学品均为市场上可买到的最高等级化学品，在收到时使用。
2.2 构建QLM@纳米花
首先将嗜热脂肪酶QLM溶解于蒸馏水中，并以6000 r/min离心15 min以去除不溶性组分（4℃）。将上清液在4℃蒸馏水中透析3天（分子量截止值：8000 Da）并冻干以获得纯化的酶。为制备固定化酶，将纯化的脂肪酶QLM（0.2、1.0、2.0、5.0和10.0 mg）溶解于19.0 mL磷酸盐缓冲盐（PBS，10 mM，pH 8.0）中，然后向样品中添加1.0 mL含有30.0 mg CuSO4·5H2O的蒸馏水（最终Cu2 浓度为6.0 mM）。将所得混合物在室温下培养3天，并且通过以8000 r/min离心1小时来收集沉淀物。最后，将所得沉淀用蒸馏水洗涤三次，冷冻干燥得到固定化酶QLM@纳米花。
为制备FITC标记的脂肪酶QLM，将FITC（30.0 mg）加入含90.0 mg纯化脂肪酶QLM的50.0 ml PBS（10 mM，ph8.0）中，室温搅拌24 h；然后将样品在4℃蒸馏水中透析3天（分子量截止值：8000 Da）并冻干过夜。准备FITC-QLM@纳米花除以FITC标记的脂肪酶QLM为原料外，其余均按上述方法进行。
2.3 QLM@纳米花的特性
在日立S4800扫描电子显微镜上，20kv加速电压下进行了扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线（EDX）图谱测量。热重分析（TGA）在TA-Q500仪器上进行，在氮气（流速50 ml/min）下加热速率为10℃/min。在扫描速度为0.2 ℃/s的PANalytical B.V Empyrean粉末衍射仪上进行粉末X射线衍射（PXRD）分析。在岛津FTIR 8400S光谱仪上捕获4000-500 cm-1范围内的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。FITC-QLM@纳米花的荧光图像在LSM 710共焦激光扫描显微镜（卡尔蔡司显微镜有限责任公司，德国耶拿）上沿Z轴以2.0mu;m的间隔捕获。
2.4 QLM@纳米花活性与稳定性分析
以p-NPC水解为模型，对游离酶和QLM@纳米花的催化行为进行了研究。简而言之，在20mu;L酶溶液或QLM@纳米花将样品加入960mu;L PBS（50 mM，pH 8.0）中，并在预定温度下将混合物预培养1 min。加入20mu;L对硝基苯酚溶液后，通过岛津2700紫外可见分光光度计在405nm处监测吸光度来分析对硝基苯基的产生。根据先前的报告[38,39]计算比活性（U/mg），其中一个酶活性单位被定义为每分钟释放1mu;mol对硝基苯基的酶量（ε=16000 M- 1 cm-1）。随后，对其热稳定性、pH稳定性、可重复使用性和长期贮存性进行了研究，QLM@纳米花除相应参数的变化外，其余均采用相同的方法进行研究。
2.5 葵花籽油与甲醇的酯交换反应
简而言之，在80.0 mg QLM@纳米花或向葵花籽油（10 ml）中加入10.9 mg游离脂肪酶QLM，然后对样品进行超声处理，使酶均匀分散。随后，添加5ml甲醇以保持油/甲醇体积比为2:1。添加0.04 mL NaOH溶液（1 M）后，在50℃下连续搅拌样品4 h，并使用Bruker Avance III NMR光谱仪（400 MHz）以CDCl3为溶剂测量葵花籽油的转化率。
3.结果与讨论
3.1 QLM@纳米花的制备及表征
以有效且容易的方法构建QLM@纳米花，如图1A所示。简单地说，将脂肪酶QLM溶解在PBS（10 mM，pH 8.0）中，在4 ℃下与CuSO4溶液培养3天，实现脂肪酶QLM在无机杂化纳米花中的组装，得到固定化酶QLM@纳米花。与金属-有机骨架固定脂肪酶QLM相比[13]，无机杂化纳米花的方法可以避免使用微量甲醇或乙醇，有利于保持酶的构象和催化活性。由于酶浓度与杂交纳米花的形成高度相关[24]，因此通过SEM观察使用不同浓度酶制备的纳米花的形态（图1B）。显然，一个多孔的花状的QLM@纳米花在所有酶浓度下均能观察到，表明无机杂化纳米花的构建是成功的。这种独特形态的形成主要是由于酶分子中铜离子与电子给体基团之间的强配位作用。值得注意的是，当使用相对较低浓度的脂肪酶QLM时，杂交纳米花表现出显著的生长，在花瓣松散的情况下。这种现象是由于在晶体成核阶段，随着脂肪酶分子浓度的增加，单个酶分子上配位的铜离子相对数量减少，从而产生较小的花瓣状团聚体，形成更为紧密的结构。当酶浓度增加到0.25 mg/mL时，杂化纳米花呈现出均匀的花状形态，平均尺寸为5mu;m（图1B和S1），并使用此酶浓度构建QLM@纳米花来进行进一步描述。
为了研究脂肪酶QLM分子是否成功地包封在杂化纳米花中，对所得产物进行了PXRD、FT-IR、元素分析和CLSM表征。如图2A所示，QLM@纳米花的PXRD图案显示出与Cu3(PO4)2纳米粒子相同的衍射峰，表明无机杂化纳米花在负载脂肪酶分子后仍保持较高的结晶度。在Cu3(PO4)2纳米颗粒的FT-IR光谱中，在1053、1150和556 cm-1处可以清楚地观察到P-O振动引起的强烈振动，在游离脂肪酶QLM中可以检测到1400 cm-1的-NH2和2800-3000 cm-1的C-H特征带（图2B）。显然，QLM@纳米花样品可以观察到Cu3(PO4)2和脂肪酶QLM的主要特征信号，说明在杂交纳米花中成功地负载了嗜热脂肪酶。此外，在QLM@纳米花
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