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肌肽合成酶作为ATP结合结构域的蛋白质1（ATPGD1）的分子鉴定
肌肽（alpha;-丙氨酰-L-组氨酸）和高肌肽（gamma;-氨基丁酰-L-组氨酸）在大多数脊椎动物和一些无脊椎动物的骨骼肌和大脑中是丰富的二肽。两种化合物的形成过程均由肌肽合酶催化，肌肽合酶可将ATP转化为AMP和无机焦磷酸盐，其分子成份未知。在目前的工作中，我们从鸡胸膜肌肉中纯化了约1500倍的肌肽合酶，直到制剂中仅存在两种主要的100和90 kDa的多肽。这些多肽的质谱分析未产生任何有意义的候选物。纯化酶催化肌肽的形成伴随着化学计量的形成，而不是AMP而是ADP的化学计量形成，表明肌肽合酶属于连接酶的“ATP家族”。一种数据库挖掘方法将ATPGD1确定为可能的候选者。由于鸡蛋白数据库中不存在该蛋白，因此我们从PCR-am扩增的cDNA中重组了其序列，发现它与鸡肌肽合酶制剂的100-kDa多肽相符。将小鼠和人的ATPGD1在HEK293T细胞中表达，纯化至均一，并显示可催化肌肽的形成（如质谱法所证实）和高肌肽。对所有三种酶进行的特异性研究与公开的数据一致。特别是他们beta;-丙氨酸的催化效率比gamma;-氨基丁酸酯高15-25倍。鉴定编码肌肽合酶的基因将有助于更好地理解肌肽及相关二肽的生物学功能，但大部分仍是未知的。
肌肽是由beta;-丙氨酸和L-组氨酸组成的二肽，于1900年首次从Liebigs肉提取物中提取，成为有史以来第一个从动物组织中分离的肽。 肌肽是一系列咪唑二肽的最著名代表，例如高肌肽（gamma;-氨基丁酰-L-组氨酸），鹅肌氨酸（beta;-丙氨酰基-N-pi;-甲基-L-组氨酸）和芥子碱（beta;-丙氨酰-N -甲基-L-组氨酸），据报道长期存在于脊椎动物的骨骼肌和中枢神经系统中。
含beta;-丙氨酰的肽主要存在于骨骼肌中，而含gamma;-氨基丁酰的肽是中枢神经系统的典型特征，这可能是由于其组织中存在其前体gamma;-氨基丁酸。 脊椎动物骨骼肌中肌肽的浓度随物种的不同而变化，从0.6 mM（小鼠）到10和30 mM（分别为人和马）。 但是，二肽在哺乳动物大脑的嗅球中也以高浓度（1-2 mM）存在，并且在某些无脊椎动物的肌肉（如蟹，虾和牡蛎）的肌肉中也已检测到。 在人脑的不同区域检测到的同型肌肽浓度为0.3–1.5 mM。 兔子腿部肌肉（17 mM）和鸡胸肌（43 mM）中含有丰富的鹅绒毛，而鲸鱼和海豚等海藻类动物的肌肉中则主要含有苯丙氨酸（最高达45 mM）。
肌肽和相关二肽的生物学功能仍然是未知的，尽管已经提出了几种理论。 由于肌肽的丰度和pKa接近生理pH，因此肌肽被认为是一种缓冲剂，可中和工作肌肉中产生的乳酸。 还已经提出它是抗糖化剂和血糖调节剂，而在嗅觉系统中存在的二肽可能是神经递质或神经调节剂。 肌肽和鹅精蛋白已被证明是体外铜离子的有效螯合剂，并且所有与肌肽相关的二肽都被认为是有效的内源性抗氧化剂。 然而，这些推定的生理功能还没有被证实。
类似地，关于催化肌肽和相关二肽形成的酶的信息仍然非常稀缺。 已知肌肽是由ATP依赖的合酶（EC 6.3.2.11）由beta;-丙氨酸和L-组氨酸合成的，该酶已从不同来源部分纯化（11-14），并显示出还催化高肌肽的合成。 尚未明确证明该反应中ATP的命运，但基于间接争论，人们认为三磷酸核苷酸可转化为AMP和无机焦磷酸盐。
研究表明，由不同基因编码的两种蛋白质可在人和其他哺乳动物中降解肌肽。 第一个（CN2，以前称为人体组织肌肽酶，EC 3.4.13.18）是在人体组织中普遍表达的锰离子依赖性胞质酶。 该酶现在被称为“胞浆非特异性二肽酶”，因为它不会降解高肌肽，并且对各种二肽具有相当广泛的特异性。 第二种（CN1，EC 3.4.13.20）是真正的肌肽酶（前人血清肌肽酶），可分解肌肽和高肌肽，并存在于血清和脑组织中。 有趣的是，这种酶的缺乏会导致高肌酸血症和高肌酸尿症，并伴有神经系统症状。
合成酶的酶的鉴定将让肌肽和高肌氨酸的作用进一步发展，这是本工作的目的。 我们选择从丰富的肌肽合酶来源的鸡肌肉中纯化该酶，并通过结合蛋白质纯化和质谱分析与数据库挖掘方法成功地鉴定了该酶。
实验步骤
材料—可能时，分析级的试剂来自Sigma，Acros（比利时盖尔），Roche Applied Science或Merck（德国达姆施塔特）。 [3H]beta;-丙氨酸和[14C]gamma;-氨基丁酸购自Moravek Biochemicals（Brea，CA）。 DEAE-Sepharose，Q-Sepharose，Superdex-200树脂，1-ml HisTrap HP（Ni2形式）和PD-10色谱柱购自GE Healthcare。 ATP-Sepharose是Serenex提供的一种礼物（给D. V.）。 AG50W-X4（100-200目）树脂来自Bio-Rad，Vivaspin-15离心浓缩器来自Sartorius（英国斯托克波特）。 酶和DNA修饰酶以及TurboFect转染试剂可从Fermentas（St-Leon-Rot，Germany）获得。 FirstChoice人脑RNA来自Applied Biosystems（比利时哈勒）。
通过用10 ml相同的缓冲液洗涤色谱柱来除去放射性标记的底物，并用5times;2 ml的含有0.5 M NaCl的20 mM Hepes，pH 7.5洗脱肌肽或高肌氨酸。 为了洗脱带更多正电荷的二肽，用5times;2 ml的1 M NH4OH洗涤色谱柱。 在所有情况下，将要计数的样品与5体积的闪烁液（Ultima Gold，PerkinElmer Life Sciences）混合，并使用Packard Tri-Carb 2300 TR液体闪烁计数器分析掺入的放射性。
鸡肌肽合酶的纯化-将鸡胸肌（250 g）与4体积（w / v）的缓冲液A（50 mM Hepes，pH 7.5，10 mM KCl，1 mM DTT，1 mM EGTA，1 mM MgCl2，用Ultra Turrax匀浆器加入5mu;g/ ml的亮肽素和5mu;g/ ml的抗痛剂。将匀浆液以15,000times;g离心30分钟，并将上清液（550 ml）分为两等份。立即使用一半，另一半在-70°C下冷冻，几天后进行相同的操作。用缓冲液A将上清液（250ml）稀释至375ml，并施加到用相同缓冲液平衡的DEAE-Sepharose柱（200ml）上。用400 ml缓冲液A洗涤色谱柱，在缓冲液A中用NaCl梯度洗脱（1000 ml中0-0.5 M），并收集馏分（7 ml）。合并两根色谱柱中最活跃的馏分（55 ml），用缓冲液B（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM KCl，1 mM DTT，1 mM EGTA，1 mM MgCl2，5mu;g）稀释至334 ml / ml的亮肽素和5mu;g/ ml的抗痛药），并加到用缓冲液B平衡的Q-Sepharose柱（12 ml）上。用36 ml的含35 mM NaCl的缓冲液B和保留的蛋白质洗涤该柱用NaCl梯度（缓冲液B中300 ml中35–500 mM）洗脱。合并活性最高的馏分（23 ml），在2个Vivaspin-15超滤装置中浓缩至2.3 ml，然后加载到用含有100 mM NaCl的缓冲液A平衡的Superdex-200 16/60色谱柱（120 ml）中。活性最高的馏分（1.5 ml）用缓冲液C（50 mM Hepes，pH 7.5，50 mM NaCl，10 mM KCl，1 mM DTT，1 mM EGTA，10 mM MgCl2，2mu;g/ ml亮肽素）稀释3倍。 ，以及2mu;g/ ml的抗痛药），并加载到用相同缓冲液平衡的ATP-Sepharose柱（0.2 ml）上。首先用2 ml缓冲液C和2 ml含100 mM NaCl的相同缓冲液洗涤色谱柱。用含有5 mM MgATP的缓冲液C洗脱保留的蛋白质（6份，每份0.4毫升）。保留五十微升用于MS / MS分析，剩余的0.35毫升补充0.7毫克的牛血清白蛋白。所有纯化步骤均在4°C下进行，并且酶制剂在两步之间存储在-70°C下。完整的纯化步骤进行了两次，结果相似。蛋白质浓度是根据Bradford分光光度法测定的，以牛球蛋白为标准品。使用ImageJ软件（NIH）通过光密度分析法对在最后一个纯化步骤（ATP-Sepharose）中与肌肽合酶活性共洗脱的SDS-聚丙烯酰胺凝胶带中的蛋白质含量进行了定量。密度测定的ATP-Sepharose馏分中的蛋白质总量与Bradford分析获得的数据完全吻合。
腺嘌呤核苷酸的测定-为了确定肌肽合成过程中腺嘌呤核苷酸浓度的变化，将Superdex 200纯化的鸡肌肽合酶样品（25mu;g蛋白）在37°C下不存在或存在1 mMbeta;的条件下孵育。 -丙氨酸和3 mM L-组氨酸的反应混合物（0.33 ml）中含有50 mM pH 7.5的Hepes，0.2 mg / ml牛血清白蛋白，10 mM KCl，1 mM EGTA，1 mM MgCl2、1mM DTT，1 mM MgATP，1 mM Na3VO4（ATPase的非特异性抑制剂）和100mu;M二磷酸腺苷五磷酸（Ap5A，腺苷酸激酶的有效抑制剂）。 在所使用的浓度下，Na3VO4和Ap5A均不影响肌肽的形成。 为了确认Ap5A对腺苷酸激酶活性的完全抑制，将酶在相同的反应混合物中孵育，其中beta;-丙氨酸和L-组氨酸已被100mu;MAMP取代。
在37°C下0、60和120分钟后，移出0.1 ml反应混合物，并与30mu;l冰冷的20％（w / v）HClO4混合以终止反应。 样品在4°C下以13,000times;g离心5分钟，立即取出上清液（0.12 ml）并用20mu;l3 M K2CO3中和。 通过离心（13,000times;g，15分钟）除去盐沉淀，并在Agilent 1100 HPLC中分析澄清的上清液（0.1 ml）。 腺嘌呤核苷酸的分离是通过在Whatman Partisphere SAX色谱柱（4.6times;125 mm，粒径为5mu;m）上以0.01–0.5 M NH4H2PO4，pH 3.7的梯度，以2 ml / min的流速进行色谱分离而实现的。 用二极管阵列检测器在lambda;= 254 nm处进行核苷酸检测。 使用ATP，ADP和AMP的外部标准品进行定量检测。
通过串联质谱法鉴定鸡肉肌肽合酶—从10％聚丙烯酰胺SDS凝胶上切下ATP-琼脂糖纯化步骤中与肌肽合酶活性共洗脱的条带，并用胰蛋白酶消化。 如参考文献3所述进行肽的凝胶内消化和脱盐。 21.在装有微型电喷雾探针的LTQ XL离子阱质谱仪（Thermo Scientific）中通过LC串联质谱法分析肽。 使用X-calibur软件（Thermo Science）对结果进行分析，并使用Proteome Discoverer（Thermo Scientific）对蛋白质进行鉴定，其错误发现率le;5％（由目标诱饵数据库搜索提供）。 为了识别鸡ATPGD1，已下载MS / MS软件（IPI Chicken，版本3.47）的鸡数据库，使用当前工作中确定的鸡ATPGD1的氨基酸序列进行更新。
鸡ATPGD1序列的确定-根据制造商的说明，使用TriPure试剂从200 mg胸膜肌肉中制备鸡总肌肉RNA。使用莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶（Fermentas，St-Leon-Rot，德国），随机六聚体和2mu;g总RNA依照制造商的说明合成肌肉cDNA。包含推定的ATG密码子的5引物（GCAGCATGATATCGGTGGAC）和包含推定的终止密码子的3引物（CCGCCGTGGTTATTTGAAGTG）用于PCR扩增编码鸡ATPGD1的开放阅读框。基于鸡全基因组Shot弹枪读数（trace-WGS）集合中的鸡表达序列标签（EST）BM487018.1和BM490056.1和鸡示踪序列TI：26256606选择5和3引物的序列。 NCBI跟踪存档。通过BLAST搜索将这些序列鉴定为与人ATPGD1同源。反应在1 M甜菜碱的存在下进行。
使用Pfu DNA聚合酶和鸡总肌肉cDNA作为模板。获得了预期大小（约2.7 kb）的PCR产物，进行了纯化和测序。全长蛋白编码鸡atpgd1序列（cDNA）保藏在GenBankTM中，登录号为GU453679。从ESTsCD648102.1，CD648025.1，CD647140.1，CD649213.1和CV089447.1（GenBank登录号BK007044）重构了atpgd1上的牡蛎序列。其他EST提供了至少2倍的整个序列附加覆盖率，并证实了推导的肽序列。
人和小鼠重组ATPGD1的过表达和纯化-在存在以下情况的情况下，使用Pfu DNA聚合酶，使用人脑，小鼠肌肉和脑cDNA PCR扩增编码人和小鼠Atpgd1的开放阅读框（分别为GenBank登录号NM_001166222和NM_134148）。 1 M甜菜碱。使用包含起始密码子（GTGGAATTCTATGCTCTCCCTGGATCCATCG）的5引物和EcoRI位点以及包含终止密码子（CAGGCGGCCGCCTATTTGAAGTGAGACAGAGAGAG）的3引物扩增人脑ATPGD1。类似地，将含有起始密码子的5引物（GTGGAATTCTATGCTCTGCCTGGATCCACTG）和含有终止密码子的3引物（CAGGCGGCCGCCTATTTGAAATGAGACAGGAAATG）用于扩增小鼠肌肉和大脑Atpgd1。使用适当的限制酶消化预期大小的扩增DNA产物，并将其克隆到pEF6 / HisB表达载体（Invitrogen）中，该载体可产生带有N端His6标签的蛋白质，并通过测序进行验证。小鼠脑和肌肉Atpgd1的序列相同，仅在进一步的实验中使用了源自肌肉的构建体。为了进行转染，将HEK-293T细胞以密度为106个细胞/板的密度接种在85毫米培养皿中，并在补充100单位/ ml青霉素，100mu;g/ ml链霉素和10％（v / v）胎牛血清，并在37℃在95％空气和5％CO 2气氛下的潮湿培养箱中生长。 24小时后，根据制造商提供的协议，使用TurboFect转染试剂（Fermentas）用6mu;g合适的载体转染每个
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