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枯草芽孢杆菌模块化途径工程促进甲萘醌-7的从头生物合成
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枯草芽孢杆菌模块化途径工程促进甲萘醌-7的从头生物合成
Shaomei Yang, Yingxiu Cao, Liming Sun Congfa Li, Xue Lin, Zhigang Cai，Guoyin Zhang,
Hao Song
（天津大学化学工程与技术学院系统生物工程(教育部)重点实验室和化学科学与工程(天津)合作创新中心SynBio研究平台，天津300072）
摘要 甲萘醌-7 (MK-7)是一种有价值的维生素K2，在预防骨质疏松和心血管钙化中发挥重要作用。我们选择枯草芽孢杆菌-168作为底盘进行模块化代谢工程设计，以促进MK-7的生物合成。MK-7的生物合成途径分为四个模块，即MK-7途径(模块I)、莽草酸(SA)途径(模块II)、甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径(模块III)和甘油代谢途径(模块IV)。首先，萘乙酸甲酯（menA）的过表达(模块一)导致在发酵120小时后产生6.6plusmn;0.1mg/L的MK-7，这是起始菌株BS168 NU(3.1plusmn;0.2mg/L)的2.1倍。其次，aroA、aroD和aroE(模块二)的过表达对MK-7的合成有负面影响。然后，dxs、dxr、yacM和yacN的同时过表达(模块三)使MK-7的产量达到12.0plusmn;0.1mg/L。此外，glpD的过表达(模块四)使MK-7的产量增加到13.7plusmn;0.2mg/L。而且，dhbB的缺乏减少了中间代谢物异辛酸的消耗，从而将MK-7的产量提高到15.4plusmn;0.6mg/L。总之，最终得到的菌株MK3-MEP123-Gly2-Delta;dhbB，在同时过表达menA、dxs、dxr、yacM-yacN、glpD和缺失dhbB，并使MK-7在2-L折流瓶中发酵144小时后，MK-7的产量将达到69.5plusmn;2.8毫克/升。
关键词: 甲萘醌-7；枯草芽孢杆菌-168；模块化途径工程；MK-7生物合成途径；莽草酸(SA)途径；磷酸甲基赤藓糖醇途径(MEP)途径；甘油代谢途径
天然存在的维生素K化合物(三环醌)包括一种植物形式--叶绿醌(PK，维生素K1)和一些细菌甲萘醌(MKs，维生素K2)。维生素K-n有14种，其中n代表侧链上的异戊二烯的单元数。维生素K是血液和骨骼中特定蛋白质的谷氨酸残基翻译后转化为gamma;-羧基谷氨酸(Gla)的重要辅助因子，因此建议每天按每公斤体重摄入1mu;g的维生素K，以满足新生儿期以外的所有年龄段的需要。PK在食物中含量较高，但生物活性仍低于MK-n(尤其是MK-7)。与PK和MK-4相比，长链MK-n(如MK-7)对正常凝血的影响更大、持续时间更长。由于MK-7具有较长的半衰期和良好的生物利用度，它广泛应用于食品、制药和保健行业的膳食补充剂或药物治疗，以预防骨质疏松症、心血管钙化和帕金森氏症。然而，治疗骨质疏松症和心血管疾病的费用很高，而且可能会随着人口老龄化而增加。2009年全球骨质疏松症药物市场估计为80-94亿美元，心血管药物市场估计为1,100亿-1,400亿美元。因此，甲萘醌类化合物有很大的市场，MK-7的生物合成也受到学术界和产业界的广泛关注。
利用纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis Natto)进行传统诱变和优化工艺发酵，生产MK-7菌株。由Song等人筛选出1-羟基-2-萘甲酸(HNA)抗性枯草芽孢杆菌纳豆突变株，其MK-7产量为3.6 mg/L。由Luo等人从日本传统食品纳豆中分离到一株纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)菌株，其发酵72h后，MK-7的产量可达32.2 mg/L。由Sato等人从纳豆枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中筛选出一株耐甲萘酮的突变株，经4d培养后产生35.0 mg/L的MK-7。Tsukamoto等人筛选出一株对海氨酸、对氟-D、L-苯丙氨酸、间-氟-D、L-苯丙氨酸和beta;-2-噻吩丙氨酸具有抗性的纳豆枯草杆菌突变株OUV23481，其MK-7产量可达1719mu;g/100g纳豆。同时，Xu等人对淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus Amyloliquefaciens)的MK-7生物合成进行了研究。他们从豆腐中分离到6株纤维蛋白原酶产生菌，发现淀粉溶解芽孢杆菌Y-2的MK-7产量为7.1 mg/L，即141mu;g/g DCW。在淀粉液化芽孢杆菌Y-2中过表达Heps进一步提高了MK-7产量的93.62%。然而，由于缺乏清晰的基因组注释和成熟的基因组编辑工具来改造纳豆芽孢杆菌和淀粉液化芽孢杆菌，进一步提高MK-7产量的合理改造在现阶段是相当具有挑战性的。
在本文中，我们选择枯草芽孢杆菌作为平台微生物进行合理的途径工程设计，以提高MK-7的产量。枯草芽孢杆菌-168(B.subtilis 168)是最具代表性的模式微生物之一，因其快速生长并符合美国 FDA 评价食品添加剂安全性指标(GRAS)而在工业应用中受到广泛关注。枯草芽孢杆菌MK-7的生物合成途径如图1所示，可分为四个模块，即MK-7途径(模块I)、莽草酸(SA)途径(模块II)、甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径(模块III)和甘油代谢途径(模块IV)。MK-7是枯草芽孢杆菌电子传递链中的一个非蛋白质组分，由分枝酸通过MK-7途径(模块I)合成。为了促进MK-7的生物合成，我们用人工双启动子PlapS原位替换了枯草杆菌基因组中驱动menFDHBEC操纵子和Heps-Meng-HepT操纵子的天然启动子，从而增加了MK-7途径的代谢通量。同时，实现了外源基因menI和天然基因menA的过表达。由于MK-7生物合成的前体是分支酸，它是SA途径(模块II)的分支点。因此，我们设计了SA途径，通过PAE表达盒分别过量表达aroA、arod、arok和aroe基因来增加分支酸的供应。MK-7的侧链由七烯基二磷酸提供，它是MEP途径的中间产物(模块III)。然后，为了增加七烯基二磷酸的供应，我们对MEP途径进行了改造，使强启动子P43上分别过表达dxs、dxr、yacM-yacN、ispE、yqiD和yqfP基因。甘油是MK-7合成的最适碳源。我们进一步改造了甘油代谢途径，通过在启动子P43上分别过表达glpF-glpK、glpD和tpi基因来提高甘油的利用率。最后，分别通过敲除ldh、alsS-alsD、arOH-trpE、pabB-PABA和dhbB基因来减少了丙酮酸、分支酸和异分枝酸的消耗。
我们系统地研究了上述4个模块中16个基因和2个操纵子的过表达以及敲除枯草芽孢杆菌中7个基因对MK-7生物合成的影响。重组菌株的发酵结果表明，menA(模块I)、dxs、dxr、yacM-yacN(模块II)、glpD(模块IV)和dhbB基因在影响MK-7生物合成中起主要作用。作为最终结果的菌株MK3-MEP123-Gly2-Delta;dhbB融合了menA, dxs, dxr, yacM-yacN, glpD同时过表达和dhbB的敲除，在250mL摇瓶发酵120h后，MK-7产量达到15.4plusmn;0.6 mg/L，是初始菌株BS168NU(3.1plusmn;0.2 mg/L)的5.0倍。在2L折流瓶中发酵72h，MK-7产量达到38.9plusmn;2.0 mg/L，是BS168NU(12.3plusmn;1.8 mg/L)的3.2倍。在添加2%甘油和4%大豆蛋白胨的条件下，发酵144h，MK-7产量则可达69.5plusmn;2.8 mg/L。
结果和讨论
增强MK-7途径的代谢通量
在枯草芽孢杆菌中，MK-7途径(模块I，图1)由9个酶反应组成。前六种酶的编码基因构成了menFDHBEC操纵子，menG基因与hepS/hepT一起构成了Heps-Meng-HepT操纵子。为了促进MK-7的生物合成，我们首先尝试提高MK-7途径的代谢通量。将起始菌株BS168NU基因组中的menFDHBEC操纵子和hepS-menG-hepT操纵子的天然启动子分别用启动子PlapS进行原位替换，得到重组菌株MK1和MK4(图2a)。因为在枯草芽孢杆菌基因组中没有鉴定出menI基因，所以我们使用了大肠杆菌中相应的menI基因，从而得到了MK2菌株。最后，我们从枯草芽孢杆菌中选择了编码1，4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA)七烯基转移酶的天然基因mena，获得了菌株MK3。
对这些重组菌株进行摇瓶发酵实验，分析它们的生长情况、过表达基因的转录水平以及MK-7的产量。如图S1a所示，这些基因的过表达对细胞生长的影响不明显。在PlapS启动子控制下，MK1中menFDHBEC操纵子的转录水平是起始菌株BS168NU中该操纵子转录水平的3.4倍，说明PlapS能有效调控基因表达。然而，经过96小时和120小时的发酵，MK1的MK-7产量与BS168NU的MK-7产量(3.1plusmn;0.2 mg/L)相比，变化不大(图2b)。一个合理的理由是，该操纵子编码的6种酶不是限制MK-7生物合成的瓶颈，而大肠杆菌中MenD的过表达诱导了甲萘醌(MK-8)的产量比对照菌株JM109(60mu;g MK-8/gWCW)提高了2倍。大肠杆菌是一种兼性厌氧细菌，在有氧条件下主要合成泛醌-8(Q-8)，厌氧条件下主要产生MK-8。枯草杆菌是一种只能合成MK-7的需氧细菌。这两种细菌在不同的氧气条件下参与呼吸链的电子传递，合成不同的醌。此外，在大肠杆菌中过表达MenI也没有提高MK-7的产量，这表明DHNA-CoA水解为DHNA(第七步)也不是MK-7生物合成的限速反应。
然而，MK3可产生6.6plusmn;0.1 mg/L的MK-7，这是BS168NU的2.1倍(图2b)，同时，MK3的menA转录水平是BS168NU的6.2倍(图S1b)。结果表明，MenA催化的第八步反应，即DHNA烯基化合成2-去甲基甲萘醌(DMK)，是MK-7途径中的限速步骤。MK4能产生4.3 mg/L的MK-7(图2b)，是BS168NU的1.4倍，而hepS-menG-hepT操纵子的转录水平是BS168NU的3.7倍(图S1b)。Heps/HepT催化FPP和IPP的四个分子缩合成DMK合成的直接前体-七烯基PP，而MenG催化最后一个反应，将DMK的甲基化为MK-7.26。然而，与MK3中仅有menA过表达相比，menA基因与Heps-Meng-HepT操纵子在MK34中的组合过表达导致细胞生长(图S1c)减弱和MK-7产量(图2d)下降。因此，选择了MK3菌株进行进一步的菌株工程。
改善SA途径提高分支酸供应
MK-7途径(模块I)由分支酸(SA途径的关键中间体)启动。SA途径(模块II，图1)在植物、藻类、真菌和细菌中普遍存在，它在细胞代谢中的重要作用是为酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)这三种芳香族氨基酸的生物合成提供前体。经过几十年的努力，大肠杆菌SA途径中的酶反应已经得到了很好地认识和研究。在大肠杆菌中，PEP和E4P缩合成3-脱氧-阿拉伯庚酸7-磷酸(DAHP)是SA途径的第一步，DAHP合成酶的三个同工酶(AroG, AroF, 和 AroH)分别受Phe、Tyr和Trp的反馈调节，而枯草芽孢杆菌只有一个DAHP合成酶(AroA)，在大肠杆菌常见的芳香族氨基酸途径中，SA激酶和3-磷酸莽草酸(S3P)1-羧乙烯基转移酶是限速酶。然而，在枯草芽孢杆菌中，3-脱氢莽草酸的AroD催化还原为SA是合成SA的限速步骤，同时过表达AroA和Arod可使枯草芽孢杆菌分批发酵的SA产量达到3.2g/L。
我们选择过表达DAHP合成酶(AroA)、SA脱氢酶(Arod)、SA激酶(Arok)和S3P1-羧乙烯基转移酶(AroE)来增加分支酸的供应(图3a)。然而，除了AroK的过表达导致MK-7产量略有增加(~5%)外，其他三种酶的过表达都抑制了MK-7的生物合成(图3b)。qRT-PCR结果显示，与MK3相比，这4个基因的转录水平确实显著提高(gt;300倍)(图S2B)。此外，这些酶的过表达对细胞生长没有影响(图S2a)。前人研究了芳香族氨基酸对枯草芽孢杆菌MK-7生物合成的反馈抑制作用。结果表明，添加3种芳香族氨基酸(Tyr、Phe和Try，各100 mg/L)显著降低了MK-7的产量，表明这3种芳香族氨基酸可能参与了对枯草芽孢杆菌MK-7生物合成途径上游的反馈抑制。因此，在枯草芽孢杆菌中过表达AroA、AroD和AroE可能会增加芳香族氨基酸的合成，进而导致SA途径的反馈抑制，最终抑制MK-7的生物合成。
改善MEP途径提高七烯基-PP供应
模块I的研究表明，MenA驱动的DHNA烯基化合成DMK是枯草芽孢杆菌合成MK-7的限速反应，因此增加七烯基-PP的供应也很重要。M
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