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抗病毒药物1％喷昔洛韦乳膏和5％阿昔洛韦乳膏用于治疗单纯疱疹病毒感染的体外皮肤渗透的评价
摘要
单纯疱疹病毒(HSV)感染是一种常见和普遍的皮肤感染，导致皮肤黏膜病变，又称为唇疱疹(口唇疱疹)或热水泡。据估计全球大约80%的人口是单纯疱疹病毒的携带者,大约有40%患有复发性感染。本研究评估体外的皮肤渗透和喷昔洛韦和阿昔洛韦的商业化乳膏为治疗口唇疱疹(唇疱疹),使用非可行切除人体腹部的皮肤样本,这暴露在5毫克/平方厘米的5%阿昔洛韦乳膏或1%喷昔洛韦乳膏。
方法：应用乳膏的24小时后，将过量的乳膏洗掉和角质层的层通过连续胶带剥离除去。大量的活性成分渗透皮肤进行测定，以及在洗掉大量在皮肤带和残留在皮肤上的乳膏。分子建模来评价药物间的物理 - 化学的差异。 蛋白质印迹法分析能够确定是否基底细胞角蛋白5的标记物可在各种带条进行检测。
结果:使用1%喷昔洛韦乳膏产生更高浓度的药物的深层表皮以及高通量药物通过皮肤。分子模型显示阿昔洛韦两个较高的疏水基团。混合物在从皮肤进入更深带条的基底细胞中有标记角蛋白5的存在，给出的证据表明，这两种药物可以到达其靶细胞。
结论：1％喷昔洛韦乳膏具有促进药物通过角质层扩散进入更深表皮层，它可能达到目标基底细胞所在有效治疗浓度。在这两个分子之间的表面性质的小差异也可能有助于喷昔洛韦的通过表皮的通道进入更深层的基底细胞。
背景
单纯疱疹病毒(HSV)感染是一种常见和普遍的皮肤感染，导致皮肤黏膜病变，又称为唇疱疹(口唇疱疹)或热水泡。据估计全球大约80%的人口是单纯疱疹病毒的携带者,大约有40%患有复发性感染。约1％潜伏疱疹感染患者频繁复发即每月爆发。这些持续4〜10天的感染，可在免疫受损的患者延长至最多30天，其中病变可能发展为广泛坏死[1]。抗病毒药物像阿昔洛韦和喷昔洛韦的局部治疗能有效缩短病灶持续时间和缓解疼痛，如今已在大型随机，双盲，车辆控制多中心临床试验[1-4]得到验证。
为获得最佳效果，抗病毒药物应能在基底表皮细胞达到治疗浓度，这是病毒传播的基本条件[5,6]。因此，皮肤吸收与局部治疗配方为成功治疗口唇疱疹的最关键因素之一。药物渗透穿过角质层途径，这是皮肤吸收主要的限速屏障[7]，取决于相应的药物的特性。喷昔洛韦相比阿昔洛韦具有附加的羟基（图1），这成为在90年代中期仿制药模拟喷昔洛韦时推出[8]。
由于角质层的渗透性能保持不变，从身体去除后，一个良好的相关性已被观察到在体内和在同一药物[9-11]体外实验。因此,通过非人类皮肤的体外扩散是一种方便可行的实验工具来探索从局部药物配方的渗透特性。
本研究比较分别含有1％喷昔洛韦或5％阿昔洛韦且都含有约40％丙二醇乳膏的体外皮肤分布和渗透。体外皮肤渗透评估使用人类皮肤安装在弗朗兹型扩散细胞[12]。在切除后, 局部应用后5毫克/平方厘米乳膏。经过实验药物浓度24 h后，在余下的皮肤最后被胶带剥离去除角质层后测定药物渗透进入扩散室的体液。此外，对药物之间的物理-化学的差异进行了研究，这是影响皮肤吸收[ 13 ]分子建模的一个影响因素。
方法
产品
在瑞士药房购买喷昔洛韦乳膏1%（10毫克/克喷昔洛韦，fenivir，诺华消费者健康，瑞士）和阿昔洛韦乳膏5%（50毫克/克阿昔洛韦；舒维疗、葛兰素史克、英国）。喷昔洛韦和阿昔洛韦由西格玛化学品（瑞士）提供。
皮肤捐赠
确保获得允许之后，国际研究所医学进步的伦理委员会（IIAM；后美国）审查和批准了本研究中对人体组织的要求使用的方法。解剖六名捐赠者完整的人体腹部皮肤厚度, IIAM提供低温贮藏。皮肤保持冷冻在-80°C。在使用之前, 将皮肤解冻并小心地将皮下组织除去。皮肤呈皮节到500微米用瓦格纳皮（型号GB-231蛇牌，德国），这让我们能够获得所构成角质层（10-20微米）的厚皮组织，表皮（100微米）和部分真皮（1200微米）[14,15]。
皮肤完整性试验
确定了皮肤的完整性，如布罗诺[ 16 ]介绍了氚化水的渗透。简而言之，氚化水（2.7mu;CI／ml）用于皮肤表面。30分钟后，在有棉絮状提示后除去皮肤放射性标记水。用液体闪烁计数器受体相（2毫升）以测量氚化水的量（%），渗透在皮肤上，用液体闪烁计数器。制剂对皮肤样品具有相似的氚化水渗透测试值。小于1%的应用剂量的氚化水渗透到皮肤。
皮肤渗透
皮肤渗透是指药物穿过皮肤层进入血管的受体阶段的扩散。它是使用1.75平方厘米为暴露于产品每个皮肤样品的静态弗兰兹扩散池5毫克平方厘米，并根据该试验准则OECD 428 [17] . 解冻人类皮片皮肤样品水平安装在弗朗茨细胞真皮的一面。将弗朗茨细胞连接到一个37°C的循环水浴中,这产生了一个32°C的组织与生理皮肤表面的温度。PBS的受体阶段pH值7.4(磷酸盐缓冲的盐水; 7.58克/升磷酸氢二钠，1.62克/ L磷酸二氢钠和4.4克/升氯化钠)包含在每个扩散细胞(大约8毫升)，使用一个磁性搅拌混合设备以确保适当的均化且受体在整个实验阶段释放药物。受体阶段收集的样本在24 h时。
皮肤渗透
皮肤渗透性的测定是通过测量居住在不同皮肤层的药物，在24小时有棉絮状提示后用肥皂水清洗皮肤样本。角质层的上面一层是用胶带去除（3米苏格兰N°550），分别将的角质层附加层进行12个连续的胶带条删除。第一、二条被放在含水10毫升的不同小瓶。带3到7是集中在同一瓶包含20毫升的水。剩下的剥去皮切碎,放入一个包含15毫升瓶水。混合物搅拌过夜,以确保从条带和皮肤充分萃取。
样品分析
用高效液相色谱法测定各样品的喷昔洛韦和阿昔洛韦的含量（安捷伦惠普1100），在35°C 5米水域reg;mu;ODS2（4.6times;250毫米分析盒pss839540）用1毫升流速对甲醇和0.1 M pH 6醋酸铵缓冲液1:10混合移动相柱（V：V）在254 nm紫外检测。样品在体积50mu;L.药物浓度直接注入喷昔洛韦或阿昔洛韦标准曲线10和50纳克/毫升的纯化合物溶于PBS pH 7.4时之间产生的决定的，这是受体相溶剂。在这种溶剂最大可溶浓度为0.9毫克/毫升的喷昔洛韦和0.7毫克/毫升的阿昔洛韦，保留时间分别为6.7分钟和5.1分钟。药物定量限（LOQ）为7毫微克/毫升。
分子模拟
基于网络化学信息系统对喷昔洛韦和阿昔洛韦化学结构的特征与使用一个内部科里纳程序进行了评价。分子表面性质的生成和显示，使我们能够揭示这些部分的分子，这是涉及到疏水性或亲水性的相互作用[ 18 ]。
免疫印迹分析
对一个供者的皮肤样本在使用乳膏，24小时后有棉絮状产生后洗掉，角质层的上面一层用胶带去除（3米苏格兰N°550），并单独分析。角质层的附加层，除去由12个连续的胶粘带。以下是所有条收集，第一、二条放在不同的小瓶。3至4条的池放在同一个瓶子，最后一条是在另一个瓶子分开放置。2mM的EGTA; 2mM EDTA的30毫氟化钠; 30毫Na4O7P2; 2毫钒酸钠; 1mM的[4-（2-氨基乙基冰冷的裂解缓冲液（20mM的Tris-HCl的250微升/胶带条的体积）苯磺酰氟（AEBSF）; 10微克/毫升亮抑酶肽; 4微克/毫升抑肽酶，1％的Triton X-100; pH 7.4）中在小瓶中，将其放置在冰块上保存10分钟，然后涡旋溶液。收集上清液并储存于-20℃温度中放置过夜。蛋白浓度用BCA蛋白质测定法（Pierce）进行测定。
蛋白质样品的十微升对应于蛋白质的3微克
带条裂解物由10％SDS-PAGE分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜（的Immobilon-P，Millipore公司，贝德福德，马萨诸塞州）。膜用含有0.2％的Tris缓冲盐水（50毫摩尔Tris，150 mM氯化钠）（体积/体积）的Nonidet P-40和5％（重量/体积）脱脂奶粉在室温下孵育30分钟阻断。膜与单克隆小鼠抗人角蛋白5（Millipore公司）抗体（1：20,000）于4℃放置过夜后进行探测，然后用次级辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG抗体（1：20,000）（转导实验室，列克星敦，肯塔基州），用于将膜与单克隆小鼠抗人角蛋白5（Millipore）中的抗体在4℃下过夜，在室温下1小时进行探测。用含有0.2％的Tris缓冲盐水洗涤三次（体积/体积）的Nonidet P-40，和抗原 - 抗体复合物通过超级信号底物法（Pierce）进行检测。使用视频密度和ImageQuant软件（分子动力学，桑尼维尔，CA）进行检测鉴定的蛋白条带。
统计分析
进行定义喷昔洛韦乳膏和阿昔洛韦乳膏之间的P值进行配对t检验。一个小于0.05的值即有统计学意义。
结果
经过24小时的曝光时间后，洗掉皮肤乳膏的皮肤和阿昔洛韦乳膏有6倍多的药物残留比喷昔洛韦乳膏更多，分别为（未显示）245mu;克/厘米和40mu;克/平方厘米。这些值代表未被吸收的药物量。
在图2a中每种药物已经累计渗透到皮肤了。当在皮肤上涂敷5％阿昔洛韦乳膏，阿昔洛韦的最高浓度在带1（0.88微克/厘米2），而在较深的连续带（条带2）的药物被发现在比从喷昔洛韦显著低浓度被发现1％乳膏（表1，P = 0.002）。在汇总条发现阿昔洛韦比喷昔洛韦少4.5倍。这种差异达到统计学意义（P = 0.07）。从1%霜喷昔洛韦在0.55mu;g/cm2在第一条时发现更深层次的连续的条带分析显示0.29mu;克/厘米在第二条喷昔洛韦在汇集带和0.32mu;克/厘米（从3条到7条）（图2A）。药物在联合带发现的总浓度可能包括与发现，3 h试验时间后按照整个表皮的表皮脱落的角质层[ 19 ]。
24小时后，1％喷昔洛韦乳膏通过皮肤渗透物的量比从5％（0.41与0.12微克/厘米2）（表1）阿昔洛韦乳膏多3.4倍，如在图2B中描绘的分别为17毫微克/平方厘米/小时的通量， 5毫微克/平方厘米/小时。
当结果比较等效剂量的1%乳膏阿昔洛韦比更昔洛韦渗透皮肤多16.7倍，这主要是限于浅表皮肤层。这种差异表明一个趋势的统计学差异（P = 0.06；图1c和表1）。在更深的如带2检测更喷昔洛韦（P = 0.002）和混合条（P = 0.04）。不同的喷昔洛韦和阿昔洛韦之间发现在真皮层接近统计学意义（P = 0.06；图1c和表1）。通过切除人体皮肤渗透达到3.3%为喷昔洛韦0.2%阿昔洛韦的应用剂量（表1）。
分子建模得能够生成并显示分子的表面特性，如静电势，亲油性潜在或极性分子的表面积暴露部分参与疏水、静电相互作用或可能导致生物利用度的差异。因此，化工模拟软件进行比较得出阿昔洛韦和喷昔洛韦为亲水性药物。如图3中的表面电荷分布非常相似，但疏水性分布显示为阿昔洛韦更高的疏水部分的两个区域。
讨论
测量从体外渗透到人的皮肤的分割厚度，使评估的分子被动扩散到整个皮肤的溶质库，模拟真皮的毛细血管。影响皮肤渗透的因素有：从制剂中释放，渗透到角质层（10 - 20mu;m），通过角质层扩散到表皮层（100mu;m）和真皮（1200mu;m），并通过流体在储层中的模拟。
相比于等效剂量喷昔洛韦有乳膏比阿昔洛韦有更高的经皮传递的趋势。这些结果表明了喷昔洛韦乳膏更有效的释放通过角质层。两种制剂含有丙二醇约40％（阿昔洛韦，5％瑞爱克斯含有40％和喷昔洛韦1％Pencivir含有43％），其被广泛地作为共溶剂和渗透增强剂[20]使用。这种脂肪醇扩散通过角质层[ 20 ]可能改变这种膜导致特别是喷昔洛韦的进的药物分布的性质，同时阿昔洛韦进一步渗透到受体液可能受损。这些结构相关的极性分子之间的这种差异可能是由制剂本身一起在疏水区阿昔洛韦结构存在的分子模型确定。这部分可能与疏水性结构在角质层防止进一步渗透有关。据报道，增加的亲脂性减少全身吸收，这是糖皮质激素[ 21 ]。如图3喷昔洛韦的亲水功能可能不与疏水性结构发生反应，从而允许自由“拉伸”，由亲水性区域内的角质层的角质细胞间的溶剂喷昔洛韦，构成旁细胞途径[13,22] 。
剥离技术可在角质层中反复应用胶带对皮肤样本进行测量，一般在10到15次之间。实验持续3小时候,据报道皮肤的角质层皮容易包括所有剩余的表皮层(15、19)。这是值得怀疑的，无论是在我们的实验条件下，在做剥离胶带24小时后，使用基础细胞可以发现在带条。知道角蛋白5在表皮的基底细胞中特异性表达[23]进行使用针对该蛋白的单克隆抗体的免疫印迹分析。如图4所示，这种技术产生的一个狭窄的、独特的60 kDa的在汇集带样品（泳道3和4），和从带条1,2和最后条带的样本大小相似的只有极弱带（上泳道5）。这个波段对应的是已知分子量的角蛋白5，这是58 kDa。
这些结果可以证明，发现基底细胞剥离胶带过程中去除，大多是在较深的表皮层。因此，每在汇集带喷昔洛韦地区的浓度以100mu;M [ 14 ]表皮深度估计量转换成浓度，取得了60倍的浓度大于体外抑制效应在0.5–0.8mu;克/毫升的IC50为温伯格[ 24 ]报道HSV-1。这表明可能在降低病毒载量的喷昔洛韦在基底表皮层细胞相比，由表皮角质层所代表的是高效率的。
值得怀疑的是，同皮肤层中的两种药物之间存在所观察到的浓度的差异是否可能是由于阿昔洛韦在不同的细胞内半衰期（0.7-1手喷昔洛韦（10-20 H）25-27]。由于切除的皮肤缺乏代谢和酶活性在使用该组织可能是不可行的 [ 28 ]。因此,这排除了本研究的实验条件下,病毒胸苷激酶可能是活跃,可能使磷酸化两种药物将保留在细胞[25]。将来它可以执行研究感兴趣的新鲜和可行切除皮肤感染或不是由1型单纯疱疹病毒酶活性的贡献评价在药物生物利用度的更深的表皮层靶细胞。
结论
在体外模型中的被动扩散的两个亲水性药物在两个可比制剂进行了研究，展示了两种药物在更深的表皮层，靶基底细胞由特定的角蛋白5蛋白的表达确定。分子建模首次揭示阿昔洛韦和喷昔洛韦表面属性之间的区别。这一观察可能支持该喷昔洛韦必须具有产生一个倾向角质层通过更高旁通道进入更深的表皮层，以达到更高的浓度的倾向。
由于角质层的渗透性
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