壳聚糖-没食子酸缀合物的合成：结构表征和体外抗糖尿病潜能的研究
摘要：在这个研究中，通过一种新颖高效的自由基调控的方法合成出壳聚糖-没食子酸接枝共聚物，并探究了最佳的反应条件、共聚物的结构表征与共聚物对alpha;-葡糖苷酶和alpha;-淀粉酶的抑制活性。结果显示，在5g/L壳聚糖（CS）、16g/L没食子酸、2g/L抗坏血酸和0.2M过氧化氢的条件下得到了最大的接枝比例（128.3mgGA equivalents/g）。相应的紫外光谱、傅里叶变换红外光谱和核磁共振氢谱都证明了没食子酸与壳聚糖的结合，它们的结合位置可能是壳聚糖2位碳的氨基、3位碳和6位碳的羟基和没食子酸酸的羧基，分别形成酰胺键和酯键。差示扫描量热法和X射线衍射表明，没食子酸接枝的壳聚糖相对于天然的壳聚糖降低了热稳定性和结晶性。但随着没食子酸接枝比例的提高，缀合物显示出更好的alpha;-葡糖苷酶和alpha;-淀粉酶抑制活性。这些研究结果显示，壳聚糖-没食子酸缀合物有可能成为一种有效地抗糖尿病物质。
- 前言
糖尿病是一种常见的因内分泌失调而引发的疾病，糖尿病分为由胰岛素分泌不足而引起的一型糖尿病和由受体对胰岛素敏感性降低而引起的二型糖尿病。餐后高血糖症在二型糖尿病中发挥着重要的影响，也易于诱发相应的心血管并发症。有一种治疗餐后高血糖的方法是抑制碳水化合物水解酶以减少葡萄糖的摄入量，例如alpha;-葡糖苷酶和alpha;-淀粉酶。这些酶的抑制剂可以延缓碳水化合物的消化并延长碳水化合物的消化时间，从而导致葡萄糖吸收速率的降低并减缓餐后血糖的提高。最近的研究表明，几种来自茶叶、柚子、草莓和葡糖等天然物质中的酚类和多糖可以有效的抑制alpha;-葡糖苷酶和alpha;-淀粉酶的活性，这些物质具有治疗二型糖尿病的潜能。
壳聚糖，一种阳离子线性多糖由以beta;-1，4糖苷键连接的葡萄糖胺和N-乙酰基葡萄糖胺的结构单元组成，并被证实具有生物可降解性、抗菌性、无毒性、无抗原性和生物相容性。所以，壳聚糖在生物医学、功能性膜和食品工业等方面有良好的应用前景。然而，壳聚糖仅溶解于一些稀酸溶液中，这极大地限制了壳聚糖的应用范围。近几年，为了改善壳聚糖的溶解性并扩大其应用范围，人们对壳聚糖的化学修饰越来越感兴趣，在众多的修饰手段中，接枝共聚的应用最广泛，壳聚糖的接枝使其在壳聚糖的骨架中通过共价键形成功能性衍生物。壳聚糖具有两种可被接枝的官能团，即脱乙酰单元上的自由氨基和3位及6位碳上的羟基。
没食子酸（GA，3,4,5-三羟基苯甲酸），是一种可以从植物中提取的天然酚类抗氧剂。最近几年，已经报到了有多种方法可以将没食子酸接枝到壳聚糖上。例如：用EDC/NHS活化的方法、用漆酶催化聚合的方法和抗坏血酸/过氧化氢氧化还原对的方法。采用氧化还原体系有许多优点：不产生有毒的反映产物和可以在室温下反应以避免抗氧化剂的降解。然而，壳聚糖-没食子酸的缀合物的反应条件和结构表征在以往的报道中并没有较好的阐述，并且之前的报道主要关注的是壳聚糖-没食子酸缀合物的抗氧化性和抗菌性。
该研究的主要目标是探究壳聚糖-没食子酸缀合物的合成条件、结构表征以及其体外抗糖尿病活性。首先，在惰性气体的环境下我们发展了一类利用抗环血酸/过氧化氢氧化还原体系合成壳聚糖-没食子酸缀合物的新颖高效的方法；其次，我们通过紫外-可见分光光度法、傅立叶变换红外光谱和核磁共振氢谱对所得的缀合物进行了结构表征。为了探讨缀合物的物理-化学性质，利用差示扫描量热法和X射线衍射分别确定了缀合物的热行为和晶体结构。最后，探究了壳聚糖-没食子酸缀合物对alpha;-葡糖苷酶和alpha;-淀粉酶的抑制活性。
- 材料和方法
2.1.试剂和药品
壳聚糖购自Sangon Biotechnology Co. Ltd.(Shanghai, China)，核磁共振氢谱显示该壳聚糖的脱乙酰度为71%，通过马克-霍温克方程测的其平均相对分子质量为2.5*105Da。抗环血酸、没食子酸、Folin–Ciocalteu试剂、D2O、pNPG、来自酿酒酵母的alpha;-葡糖苷酶、猪胰腺alpha;-淀粉酶和淀粉浆购自Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)。经济可得的阿卡波糖片购自Bayer HealthCare Co. Ltd. (Beijing, China)。所有的试剂均是分析纯。
2.2.壳聚糖-没食子酸缀合物的合成
壳聚糖-没食子酸缀合物是在惰性气体的环境下通过抗坏血酸/过氧化氢氧化还原对来合成的。在每次的试验中，取计算量的壳聚糖（2.5-20g/L）溶于50ml2%的乙酸溶液（v/v）中，将壳聚糖溶液装入一个0.5L的三口烧瓶中。之后，取计算量的抗坏血酸（1-10g/L）和没食子酸（2-20g/L）加入到反应器中，缓缓地通30min无氧氮气。之后，向反应器中滴加过氧化氢溶液（0.025-0.25M）。该反应在持续通入无氧氮气的条件下进行。在需要的时间周期（1-16h）后，通入空气以停止反应。用14000Da的透析袋对反应混合液透析72h以除去未反应完的没食子酸。
通过高效液相色谱法确认所得的透析液中不含有未反应完的没食子酸。色谱系统由CBM-20A系统控制器、LC-20AT溶剂发送模块、SIL-20A自动进样器和SPD-20A紫外检测器构成，采用反向岛津色谱柱，流动相流速为1ml/min，操作温度为25℃，流动相为80%乙腈-20%0.1%甲酸溶液。最后透析液被冻干成水溶性的壳聚糖-没食子酸样品。
2.3.壳聚糖-没食子酸中没食子酸接枝比例的检测
壳聚糖-没食子酸中没食子酸的接枝比例采用改良的Folin–Ciocalteu法进行检测。取10mg壳聚糖-没食子酸冻干粉末溶解在乙酸水溶液中（0.5%,v/v）。取1ml样品溶液（稀释到可在标准曲线附近测的其吸光度）和1mlFolin–Ciocalteu试剂（稀释十倍）混合，并在30℃的黑暗环境中反应5min，随后加入5ml饱和碳酸钠溶液，混合液放置2h后在760nm附近测定其吸光度，结果用每克壳聚糖-没食子酸冻干粉末中的没食子酸的毫克数表示。
2.4.壳聚糖-没食子酸缀合物的结构表征
为了确认没食子酸是否成功地接枝到壳聚糖骨架上，我们通过紫外-可见光谱、傅立叶变换红外光谱和核磁共振对所合成的缀合物进行了结构表征。紫外-可见光谱由Lambda 35检测器(PerkinElmer Ltd., USA)测得。原始的和被接枝的壳聚糖（0.5mg/ml）被溶解到乙酸水溶液（0.5%,v/v）中，之后通过从200nm到600nm的扫描进行检测。红外光谱通过Varian 670 FT-IR的连续扫描被记录下来。干燥的样品和溴化钾一起被研成粉末并被压成薄片，在4000-400cm-1的范围内进行扫描。核磁共振氢谱通过将样品溶解在氘代乙酸/重水（1%,v/v）中于25℃下在AVANCE-600 spectrometer (Bruker Inc., Germany)中进行检测。核磁共振碳谱在AVIII 400 MHz WB spec-trometer (Bruker Inc., Germany)中检测，频率为100.62Hz并配有双共振H/X CP-MAS4 mm probe。MAX比例被固定在9000Hz并且每个实验都是在环境温度下进行的。
为了研究壳聚糖-没食子酸的物理-化学性质，同样测定了其热行为和晶体结构。壳聚糖和接枝共聚物的热力学性质在铝锅中用DSC 8500 (PerkinElmer Ltd., USA)被测定出来。在20ml/min的氮气流下，以10℃/min的速率将样品从30℃加热到300℃。用Ni-filtered Cu Kalpha;辐射在Bruker AXS D8Advance X-ray检测器中从10-80°进行检测。
2.5.alpha;-葡糖苷酶抑制活性的检测
为了评估壳聚糖-没食子酸的体外抗糖尿病的可能性，分别用壳聚糖-没食子酸冻干粉末对alpha;-葡糖苷酶和alpha;-淀粉酶进行了检测。壳聚糖-没食子酸对alpha;-葡糖苷酶抑制活性的检测采用的是改良的Kim法。将alpha;-葡糖苷酶（50uL,1U/ml）和0.5ml待测样品（0.01-10mg/ml的壳聚糖-没食子酸冻干粉末）混合在0.2M pH=6.8的磷酸盐缓冲液中，在37℃下预热10min，3mMpNPG作为反应底物被加入到混合液中以开始反应。该反应在37℃下保温30min并通过加入1ml 0.1M碳酸钠溶液终止反应。然后在405nm出测定反应混合液的吸收波长。阿卡波糖被用作正对照。alpha;-葡糖苷酶的抑制活性用下面的公式进行计算：抑制活性（%）=（1-（A1-A2）/A0）*100，其中A0为控制组的吸光度（没有加入样品的磷酸盐缓冲液），A1是样品的吸光度，并且A2是空白组的吸光度（没有加入pNPG的磷酸盐缓冲液）。IC50值表示使50%的alpha;-葡糖苷酶受到抑制的化合物的浓度。
2.6. alpha;-淀粉酶抑制活性的检测
壳聚糖-没食子酸对alpha;-淀粉酶抑制活性的检测采用的是改良的Wang法。2mg淀粉作为反应底物被分散到含0.01M氯化钙的0.2ml 0.5M pH=6.9的Tris-HCl缓冲液中，并在沸水中溶胀5min。将所得到的淀粉浆放置在27℃下预热5min。将含有0.2ml待测样品（0.01-10mg/ml的壳聚糖-没食子酸）、0.2ml猪胰腺alpha;-淀粉酶溶液（2U/ml）和0.2ml淀粉浆的混合液用力振摇，并在37℃下孵化10min。在加入1ml乙酸（50%,v/v）后，混合液在5000*g下离心10min。然后在595nm处测定上清液的吸光度。阿卡波糖被用作正对照。壳聚糖-没食子酸对alpha;-淀粉酶的抑制活性用下面的公式进行计算：抑制活性（%）=（1-（A1-A2）/A0）*100，其中A0为控制组（没有加入待测样品的Tris-HCl缓冲液）的吸光度，A1是待测样品的吸光度，A2是空白组（没有加入淀粉浆的Tris-HCl缓冲液）的吸光度。IC50值表示使50%的alpha;-淀粉酶受到抑制的化合物的浓度。
2.7.统计分析
三个组的数据被表示成偏差 标准偏差。通过SPSS 13.0软件包，邓肯测试和单向方差分析被用作多重比较。当plt;0.05时，三组数据的差异具有统计学意义。
3.结果和讨论
3.1.壳聚糖-没食子酸的合成
将没食子酸连接到壳聚糖链上是在惰性气体的环境下通过抗坏血酸/过氧化氢氧化还原对的条件实现的，在Fig.1中展示了壳聚糖没食子酸合成过程的可能的机理。在乙酸溶液（2%,v/v）中，抗坏血酸是一种二元酸，并且可以和过氧化氢发生氧化还原反应产生羟基自由基和去氢抗坏血酸自由基。去氢抗环血酸自由基的pK=-0.86，在反应体系的酸性环境下，去氢抗坏血酸没有被质子化，而是进一步形成去二氢抗坏血酸自由基。羟基自由基作为合成壳聚糖-没食子酸缀合物的引发剂，它可以夺走壳聚糖分子中的活泼氢并产生壳聚糖巨自由基。接近壳聚糖巨自由基活性位点的没食子酸分子将成为壳聚糖巨自由基的受体，从而生成壳聚糖-没食子酸缀合物。
3.2.反应条件的优化
可改变的反应因素包括壳聚糖的浓度、没食子酸的浓度、抗坏血酸的浓度、过氧化氢的浓度和反应时间，这些影响因素都通过控制变量法进行了相关的研究。如Fig.2所示，随着壳聚糖的浓度由5g/L增加到20g/L，接枝比例持续减少，这是因为随着反应介质粘度的增加，会阻碍没食子酸单体与壳聚糖巨自由基上活性位点之间的接触；随着没食子酸单体浓度的提高，接枝比例随之增高，因为这样可以增大没食子酸单体与壳聚糖巨自由基的接触概率；同时，在一定范围内增大抗坏血酸和过氧化氢的浓度可以提高接枝比例，因为随着产生的羟基自由基的增加，这些自由基可以和壳聚糖骨架反应产生更多的壳聚糖巨自由基，壳聚糖巨自由基产生的越多便可以获得相应更高的接枝比例。然而，在上述浓度范围以外，则会由于大量自由基的氧化作用而使反应难以进行。根据控制变量法的实验结果，获得最大接枝比例（128.3mg GAE/g GA-g-CS）的实验条件是反应时间12h，试剂用量为壳聚糖5g/L、没食子酸16g/L、抗坏血酸2g/L和过氧化氢0.2M。这个接枝比例高于文献7中所述的两种方法，分别是通过在大气中利用抗坏血酸和过氧化氢反应得到的58.1mg GAE/g GA-g-CS和利用EDC/NHS活化得到的118.92mg GAE/g GA-g-CS。能够获得如此高的接枝比例可能是因为氮气的保护作用，氮气的保护可以使没食子酸不被氧化，从而提高反应的接枝比例。
3.3.壳聚糖-没食子酸的表征
为了确认没食子酸是否成功地接枝到壳聚糖上，三种不同接枝
剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
英语原文共 9 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料
资料编号：[148177]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word
以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
