姜黄素纳米系统的结构与表征
摘要：本研究旨在开发一种姜黄素纳米颗粒系统，姜黄素是一种被广泛使用的传统中药，但是其水溶性差。因此，本研究的目标是提高姜黄素体外释放特性，增强其在血液和胃肠道的稳定性，并增加其生物利用度和药理活性。姜黄素纳米粒子系统（Cur- NS）的制备是运用离子凝胶技术。Cur- NS通过对合成的纳米粒子的粒径、Zeta电位、药物包封效率、载药量和物理稳定性分别进行考察而进行相关评价。Cur-NS的控制释放性能和姜黄素从纳米系统中释放出来的特性符合非菲克机制，从聚合物载体的交联层，可以达到预期的扩散释放，腐蚀或溶解。此外，大鼠体内的药代动力学研究发现姜黄素纳米系统显著的提高了姜黄素的口服生物利用度，以及在对肿瘤生长调查中表明，Cur- NS能使体内抗肿瘤活性增加。与空白组比较，Cur-NS有明显抑制肿瘤的疗效，这使得Cur-NS治疗癌症有一个很好的前景。
关键词： 姜黄素，纳米粒，体外释放生物利用度，抗肿瘤疗效，纳米医学
前言
姜黄素，一种二酚类，来自于姜黄植物姜黄根茎（多年生属于姜科的草本植物广泛分布在南亚和东南亚的热带地区），在1815年首先被分离出来，1910年其化学结构被确定（Pari et al. 2008），姜黄素被认定为1,7-双（4-羟基-3-甲氧基苯）—1,6-庚二烯-3,5-二酮（阿南德等人。2008；Aggarwal和Sung2009）。随着全球各地的研究人员进行的大量研究，已经清楚地表明作为一个新一代的领域，姜黄素有着巨大潜力。其通过调制众多的分子靶点（Yadav等人。2013；Wilken等人。2011），为治疗各种各样的疾病铺平了道路，如糖尿病，心血管疾病，关节炎，老年痴呆症，牛皮癣等（Basnet and Skalko-Basnet 2011; Aggarwal et al. 2013;Hatcher et al. 2008），以及抗癌活性，包括白血病，胃肠道肿瘤，肺肿瘤，泌尿生殖系统肿瘤，乳腺癌，卵巢，头颈部鳞状细胞癌，黑色素瘤，神经系统肿瘤。
然而，在过去的几十年研究里，有关姜黄素的体内分布显示了它的吸收差和快速代谢，即使在高剂量，也严重降低其生物利用度，（Anandet al. 2007; Shehzad et al. 2010; Bhawana et al. 2011）。此外，在高剂量，它可引起胃部不适。由于可能引起恶心的感觉和知觉的毒性问题，它未被纳入临床应用。
在实践中，只有非常低或检测不到的姜黄素含量水平在血液和组织中可以确保其安全，但发挥治疗作用则需要更高的剂量给药。姜黄素生物利用度低归因于它非常低的水溶性，在生理环境中，其在胃肠道中有降解的趋势，高代谢速率，快速系统消除。这些限制了其潜在的开发利用价值的治疗效果（Bhawana et al. 2011;Kumar et al. 2010）。
纳米技术为基础的新战略正在世界范围内积极探索提高生物利用度和降低抗癌药的毒性的药物。在这里，一个新的应用双重乳液状自组装技术被建议做一个纳米粒子系统（NS）将包含不溶于水的药物，含量高的活性药物和可控释药率。由美国学者Bhavsar和Amiji在2007年提出的技术，构想配制成封装壳聚糖或可生物降解的其他纳米系统微球矩阵。纳米粒子系统是一种有效的载体，并期望拥有一些额外的潜在的有益的特性，如良好的血液稳定性及胃肠道稳定性，增强溶出速率，控制释放特性，高细胞摄取，多功能设计，增强其药理活性等。在这种技术中，通过脱乙酰甲壳素生产的壳聚糖是一种天然的多糖。它，作为一个最广泛被研究的可用聚合物载体材料，具有无毒性、生物相容性的性质，低免疫原性，生物降解性，粘附性、抗微生物活动（(Khalil et al. 2012; Bonderer et al. 2008），并已广泛应用于医药行业
作为口服和肠外制剂的聚合物载体。通常地说，NS装配技术是自发的在相反电荷之间形成聚阳离子/阴离子大分子，这可作为一个药物控释装配系统。这个相互作用的分子建立在阳离子和阴离子的离子交联以及聚阴离子三聚磷酸钠（TPP）。聚电解质颗粒的形成被应用于封装不溶于水的药物，这是一个新的有前景的领域（Agarwal et al. 2008）。
在这项研究中，双封装的纳米对于水溶性差姜黄素可以增加其溶解性和通透性，针对临床应用，可以增强药物稳定性，提高溶出度和生物利用度，减少服药次数，提高患者服药依从性。
开发的这种制剂，其表征是评估形态、粒度和Zeta电位以及在体外释放和稳定性研究评估。此外，在姜黄素纳米粒体内抗肿瘤活性的研究系统（Cur NS）对肿瘤生长的影响中，用人肝癌移植瘤模型细胞（SMMC-7721），它提供了实验和恶性肿瘤应用生理盐水的理论基础化疗。
实验
材料与试剂
姜黄素（纯度C95%）购自Sigma，顺铂（纯度C99%）是从中国南方医药有限公司获得，丙酮（c99.5，ACS试剂级），低分子量的CS和三聚磷酸钠（TPP，分子量367.9）是从从Sigma（中国）购买。所有其他化学物质所用试剂纯度均为分析纯或纯度更高，均为商业购买所得。
方法
Cur-NS的制备
Cur-NS变性离子凝胶的形成方法如前面所述（Bhavsar and Amiji 2007; Sun et al. 2012），CS聚阳离子与TPP聚阴离子相互作用形成中间体。将溶于乙醇的姜黄素溶液加入到壳聚糖溶液中（0.6%，w/v），在稀醋酸中溶解壳聚糖（1%，V / V）并在室温添加吐温80（2%，v/v）。用磁力搅拌器使其混合均匀，形成水包油的乳液。TPP溶于去离子水中以5mg/ml（w/v）的比例，然后逐滴直接滴加到先前所制得的乳液中（Sun et al.2012）。因此，在室温下经过磁力搅拌（100 rpm）的纳米粒子在逐滴加入TPP溶液时瞬间形成。在配方中，纳米粒子的构建中CS / TPP比例保持在3:1（w/w）。因此会产生的胶体组装系统，即纳米制剂，需要连续搅拌30分钟，并将获得的产品离心20分钟以5000转以分钟的转速，然后用蒸馏水洗涤除去其中所含的乙醇。
药物的包封率和载药量的测定
包封率（EE）的测定是通过超速离心法（160009g，20min，4℃）测定分散介质中游离药物浓度。取上清液,用90%乙醇稀释,所得药物溶液浓度测定采用反相高效液相色谱法使用SPD-10Avp Shimadzu泵和LC-10AVPShimadzu紫外可见检测器测得，并用色谱分离法采用反相不锈钢柱（4.6 mm 9 250 mm, 5 lm,hypersil ODS2）与流动相乙腈和0.4%磷酸的混合物56:44（v/v）组成的酸性水溶液以流速为1ml/min进行分离。
药物包封率和载药量（DL）的计算通过公式（1）及（2）：EE%=（Wtotal-Wfree）/Wtotal*100 （1），DL% =（Wtotal-Wfree）/Wcarriers*100 ( 2 )，公式中wfree是取自上清液中所分析的游离药物的质量，Wtotal是纳米系统分散体中所分析的药物的总质量，Wcarriers是载体的总质量。Cur-NS的制备的最佳条件是选择针对载药姜黄素，对其在包封率，载药量，粒径，形状以及释放曲线，多分散性指数和z电位作进一步调查。Cur-NS在测量前用磷酸盐缓冲液稀释（PBS）（pH 7.4）。平均粒径、多分散性指数，和z电位测定采用激光光散射（Zetasizer 3000sh，马尔文仪器有限公司，英国）。
稳定性研究
将Cur-NS在4摄氏度密封保存 10个月。药物的包封率和平均粒径分别在固定的时间间隔进行测定。
体外释放实验
NS体外释放测定是在水槽条件下，用透析袋扩散技术。取姜黄素溶液2毫升（5毫克/毫升，溶于90%乙醇）和姜黄素生理盐水2 ml（相当于10毫克姜黄素）装入透析袋（分子量截止14000 - 12000，Sigma）（Sun et al.2008）。然放将透析袋放入含有200毫升溶出介质（pH 7.4 PBS）的瓶中，然后将瓶放入水浴（37°0.5）中以转速为100转每分钟旋转。培养基中（5毫升）的部分的溶出度测定，以相同时间间隔收回和添加相同体积的新鲜溶解介质以保持恒定体积。溶出介质中的药物浓度采用之前描述的反相高效液相色谱方法。所有的实验进行了一式三份。结果取平均值。
生物利用度研究
Cur-NS的药代动力学性质和姜黄素悬浮液（cur-s）（10毫克/毫升，溶于0.5%羧甲基纤维素钠水溶液）作比较，对大鼠实验口服性剂量为100毫克/千克。大鼠体重280，20克，由实验动物服务提供齐齐哈尔医学院中心。研究是按照协议进行的国家批准的要求使用实验动物（人的中华民国）。被安置在常温条件下的大鼠，实验之前禁食一整夜，但可以获得水。这些大鼠被随机分为2组，每组6只大鼠。样品组直接采用口服灌胃针将样品药物打入。打入药品之后，在以下时间间隔0.083，0.167，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8，0.25，和12。通过臀部静脉丛肝素抗凝管，分别收集约0.25毫升的血液，然后将获得的样品离心（15分钟，4000转），在进行分析之前存储在- 20摄氏度。药代动力学分析采用上面提到的方法：高效液相色谱法，使用该药物和统计法（DAS 2.1.1程序，数学药理学专业委员会，中国）。
细胞系与细胞培养
人肝癌细胞株SMMC-7721是从细胞生物学上海研究所获得的肝癌。细胞培养在无血清细胞冻存培养基1640中（Sigma）辅以10%（体积/体积）热灭活胎牛血清，2毫米谷氨酰胺，和10毫摩尔的HEPES缓冲液，并在37plusmn;0.5 C在潮湿的大气（5%二氧化碳95%空气）中，0.02%（w/v）EDTA的磷酸盐缓冲溶液，在短暂的潜伏期获得菌种（ICN，Aurora，OH，USA）。
体内抑瘤作用
Cur-NS体内的抗癌疗效评价是通过荷瘤裸鼠的实验。无胸腺（nu/nu）BALB/c小鼠，年龄为4-6周，安置在一个无特异性病原体的环境中，将其随机分成4组，每组6只。所有研究实验遵循动物实验人道准则和佳木斯大学的动物实验委员会指南。SMMC-7721细胞（1 9 107）悬浮于100LL的基质胶体中（合作的生物医学产品，贝德福德，MA，USA），然后皮下注射到老鼠的右前侧腹。一周后，当平均肿瘤体积达到0.1–0.2 cm3，小鼠（4组）分别进行不同的实验措施。给第一组的小鼠腹腔注射姜黄素溶液（溶解在90%乙醇，相当于100毫克/千克），二天8次。给第二组小鼠注射空白纳米溶液，二天8次。给第三小鼠组，腹腔注射顺铂（5毫克/公斤，每星期2次共二周），作为一种积极治疗。给第四组小鼠均腹腔注射不同浓度姜黄素-纳米粒（相当于每公斤50、100、150毫克姜黄素，每二天8次）。肿瘤生长率抑制被定义为一个比率，即与对照肿瘤重量的比率。另外，在研究中，肿瘤大小的测量是交替的进行的。使用游标卡尺的使用测量肿瘤的长度（L)和宽度（W），并且用公式计算肿瘤体积（V）V =L * W*W / 2，其中L和W是最大值，放大率为最小值。所有数据取品均值。根据学生的t分布检验差异进行评估。统计意义被设置为P:0.01或P:0.05。采用SPSS统计分析win11.0软件（SPSS公司，芝加哥，IL，USA）。
结果与讨论
姜黄素纳米系统的制备与表征
离子凝胶技术被广泛应用于药物封装。在本文中，利用改进的离子凝胶法制备双包封的纳米系统。聚阴离子形成网状结构，通过结合主要由壳聚糖提供的多价阳离子形成聚电解质络合。
该方案是将载药的聚合物溶液滴加到多价阳离子的水溶液中。聚阳离子扩散到载药聚合物颗粒中，自发形成一个离子交联的三维晶格结构。该组合系统中，多聚磷酸钠与壳聚糖（C/T比率）和药物与载体的重量比率（D/C比率）被认为是影响Cur-NS包封率的关键因素。但这没有显著的影响药物的载药率。随着C/T比率的增加，形成的颗粒尺寸减小，药物包封率增加。然而，C／T比值越大，药物包封率减少，但颗粒大小增加，这是因为较低的电势导致颗粒易团聚。此外，与增加D/C比，颗粒大小没有显著的变化，但药物DL和EE首先会增加，然后下降。考虑这些综合的影响因素，在这项研究中，找到最佳的D / C比值（1:8，w/w）和T / C比值（3:1，w/w）。Cur-NS构型为表面光滑的球形（图1），发现其形状大小相对来说是一致的，在图2中（110.5plusmn;5.6纳米），并且呈现了Zeta电位（18.3plusmn;0.7 mV），这使电荷表面产生静电斥力，提高了系统的稳定性。药物EE和DL相对而言比较高，分别为84.2plusmn;2.50和13.7plusmn;0.12%，因此增加了难溶性药物载药量。
稳定性研究
姜黄素在4℃稳定性试验显示在表1中。结果表明，平均颗粒大小和药物包封率在10个月内无明显变化，自组装的双乳胶状确实保持了较高的稳定性。然而，轻微改变了也呈现出了这样的结果，EE（%）下降，平均粒径随着贮藏时间的延长而增加，对于纳米粒来说，冷冻干燥的粉末可能是一个替代的解决方案，以进一步提高其物理稳定性。
体外释放研究
改进后的释放实验是在至少加入1%的十二烷基磺酸钠硫酸盐（SDS-Na）（Zhang et al. 2011）水槽条件下进行的。这能提高姜黄素的溶解度和改善其释放特
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