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金纳米棒在光动力疗法、热疗法和近红外光学成像的
应用研究
当材料的大小缩小至纳米级，其进一步的缩小和形状的改变将变得灵敏。在目前被运用改进的纳米材料中，金纳米颗粒因其优良的稳定性和生物相容性被广泛地应用于生物体中。在生物医学应用中我们都会用到可持续深入穿透血液和软组织的近红外光（NIR），为此我们需要应用不同的金纳米结构。表面等离子体共振（SPR）指自由电子在纳米结构中共同振动，散射或吸收伴随而至的电磁波的现象。先前的研究给我们演示了用多种方法用近红外照射金纳米结构并观察其SPR，结果展示了金纳米材料在生物学应用的潜力。近红外光在组织传播时的散射和吸收都很小，传播效率优良，因此可以提供最大强度的穿透组织的光辐射并且将非目标组织的自发荧光现象减至最低。吸收近红外光的金纳米结构在生物学中有广泛的应用，特别是金纳米棒。它可应用于等离子体共振光散射、瑞丽弹性散射、表面拉曼非弹性散射、光子相断层扫描、双光子非线性成像和光热治疗。
金纳米棒在光热疗法中所出现的潜力备受关注。但是对纳米棒与热敏剂结合并在光动力疗法（PDT）中应用的关注不够。PDT是一种利用高活性单线态氧破坏癌细胞从而达到治疗目的的治疗方法，单线态氧是指需氧细胞在代谢过程中产生的活性氧副产物，活性高可破坏细胞，而光敏剂在适当波长的光照后可生成出这种单线态氧。金纳米棒与亲水性的阴离子光敏剂——吲哚菁绿（ICG）结合（信息支持，图S1），在近红外光照射后便可引发PDT进行。再者，令ICG处于激发状态的波长和其强度最大的发射光的波长都与近红外的波长相近，因此ICG-金纳米棒可以作为生物医学成像中的造影剂。
近年来也有人开始将纳米材料运用到癌细胞的早期检测和破坏当中，也有人从事发展多功能的纳米材料。在这种环境下，在此，我们打算提出一种使用致命的光裂解反应的医学诊断方法，展示多功能的ICG-金纳米棒可同时触发光动疗法和光热疗法去破坏癌细胞。毕竟PDT和热疗的结合将比分开使用更有效地消灭癌细胞，不仅如此，这个系统在近红外领域中可作为有效的生物成像探针。
为了让ICG与金纳米棒结合，我们运用无核生长方法合成了表面覆盖溴化十六烷基三甲胺（CTBA）表面活化剂的金纳米棒，接下来我们将CTBA连同聚苯乙烯马来酸酐共聚物（PSMA）和ICG一个按顺序地通过静电作用覆盖到纳米棒的表面。一张透射电子显微图（TEM）（图1）展示了长宽比约为3.8（长35nm，宽9.3nm）的金纳米棒。因为CTAB的存在，在金纳米棒的表面电荷形成可大约39.2mv的电势。PSMA聚合物首先在NaOH中进行水解并暴露出羧基，再通过静电作用被纳米棒吸附。图1b展示了吸附着带负电的PSMA的Au-PSMA纳米棒；Au-PSMA金纳米棒的表面电势大约为-10.7mV。通过PSMA的苯基和ICG的苯基之间的Pi;-Pi;沉积作用，ICG可吸附于Au-PSMA纳米棒上从而形成Au-PSMA-ICG纳米棒（图1c）。
金纳米棒有两种等离子体共振方式，也就是横向等离子体共振（ca.520nm）和纵向等离子体共振(ca.800nm)。当纳米棒被PSMA覆盖时，纵向等离子体共振变成一个宽带并延伸至950nm（信息支持，图S3）。ICG的紫外可见分光光谱中有两个主峰，分别大约位于708nm（低聚物形式）和780nm（单体形式）。当金纳米棒与ICG结合后，会在大约720-770nm和830-900nm处出现两个带。这个变化主要是因为染色聚合物形成了二聚物、三聚物和PSMA的苯基与ICG的苯基之间的Pi;-Pi;沉积作用所导致的ICG吸收红移。在红移后，横向等离子体共振消失。由此可见，紫外可见分光光谱可以验证Au-PSMA与ICG是否成功结合。在研究中，我们使用了比尔-朗伯定律估算了平均每个Au-PSMA能与多少ICG结合，同时测量ICG在与金纳米棒结合前后的吸收差异。结果显示，大约平均每个Au-PSMA金纳米棒可以与28100个ICG分子结合。
为了进一步展示ICG的成功结合，我们用傅氏转换红外线光谱（FTIR）对Au-PSMA-ICG金纳米棒进行了特征确定（信息支持，图S4）。其特征IR带说明PSMA和ICG很好的按顺序结合到金纳米棒上。同时，我们运用色散X射线荧光光谱和X射线衍射测量方法去研究纳米棒的各种特性（信息支持，图S5）。通过这些特征确认，我们可以证明PSMA和ICG都很好的与金纳米棒结合。
接下来我们对Au-PSMA-ICG金纳米棒的细胞毒性进行了研究。我们的细胞存活率实验的内容为在暗处培养带有Au-PSMA-ICG金纳米棒的人类肺癌恶性细胞系24小时（所有包含ICG的PDT实验都在暗处进行）。实验中我们使用了约数量为5*1011金纳米棒，结果显示细胞存活率约为100%，证明了Au-PSMA-ICG金纳米棒有良好的生物相容性（信息支持，图S6）。
Au-PSMA-ICG对近红外有吸收，因此在近红外的照射下这些具有生物相容性的金纳米棒可以以光热和光动力的方式去杀死癌细胞。A549细胞系因表皮生长因子受体（EGFR）的基因过度表达，在其细胞表面有过多的表皮生长因子受体，因此我们用A549细胞进行对Au-PSMA-ICG金纳米棒的光热疗和光动力疗法的效果的研究。通过对蛋白质印迹的观察，人类角化细胞良性细胞系（HaCaT）因为其表皮生长因子受体的基因的表达缺乏，其表面的表皮生长因子受体数量明显地少于A549细胞系。为了使近红外光裂解能靶向进行，我们将EGFR的抗体（AbEGFR）分别与ICG、Au-PSMA纳米棒和Au-PSMA-ICG纳米棒结合。EGFR抗体（1mg/ml）与上述三种材料都是以1:1的体积比混合，能结合的原因是ICG、Au-PSMA纳米棒和Au-PSMA-ICG纳米棒的负电荷与EGFR抗体的正点部分之间发生了静电作用。我们使用连续波激光二极管发射波长为808nm（输出功率：22.5W/cm2,激光光斑面积为1mm2）照射用Au-PSMA-ICG纳米棒处理的A549细胞，从而引起光裂解。细胞都使用乙酰羟甲基酯钙（calcein AM）指示剂作处理，用激光处理使ICG产生足够的ROS和使PDT充分进行后，把细胞移至暗处继续培养2小时。图2展示了A549细胞在波长为808nm的近红外光照射了30s到3min的结果。需要说明的是，没有绿色荧光的区域表示有明显的细胞凋亡现象。用没有与EGFR结合的ICG、Au-PSMA纳米棒和Au-PSMA-ICG纳米棒处理的细胞均未出现凋亡现象。（图2a）因为PDT和光热效果的缘故，用ICG-AbEGFR和Au-PSMA-ICG纳米棒-AbEGFR处理的细胞在照射一分钟后出现了细胞凋亡现象，而用Au-PSMA纳米棒-AbEGFR PSMA纳米棒-AbEGFR处理的细胞在
图2.通过荧光展示A549恶性细胞的光裂解情况。在能量密度为22.5W/cm2的近红外（808nm）照射后使用没有a)有b）和EGFR抗体结合的ICG、Au-PSMA纳米棒和Au-PSMA-ICG纳米棒处理的A549细胞的荧光图。金纳米棒的用量是5*1011。游离的ICG和Au-PSMA纳米棒的量固定在2.334*10-4m。虚线圈表示激光光斑。细胞在光照后都用乙酰羟甲基酯钙处理并在暗处培养2小时；活细胞均发出出绿荧光。比例尺：1mm。
2分钟后才出现细胞凋亡现象（图2b）。光照后细胞将在暗处继续培养2小时，之后的观察结果会与照射后的结果相对比（信息支持，图S8）。观察的结果发现，由于ICG产生了大量的ROS和正在进行的PDT，随着培养时间的增加，空白区域（凋亡细胞的区域）会慢慢扩大。另一方面，我们使用不同用量（从5*1011到1*108）的与EGFR抗体结合的材料进行2分钟的相同强度照射。从这个实验我们可以看出，Au-PSMA-ICG纳米棒在1*109用量下便可以引起细胞凋亡，在此用量下，仅用ICG处理的细胞并没有出现凋亡现象。实验中我们进一步检测与Au-PSMA-ICG纳米棒结合的EGFR抗体的浓度。AbEGFR（1mg/ml）与Au-PSMA-ICG纳米棒（5*1011）以体积比为1:1到0.001:1来混合。用近红外照射的结果表明，空白区域的面积将会随着体积比的减小而减小，并且在0.001:1时便出现细胞凋亡现象。因此我们可以看出与Au-PSMA-ICG纳米棒结合的AbEGFR的浓度与光裂解效率成正比，也同时说明Au-PSMA-ICG纳米棒比Au-PSMA纳米棒和ICG单独使用更有利于促进PDT和热疗。
因为我们都知道ICG在波长为808nm的近红外照射下可以产生单线态氧，因此有需要对单线态氧进行直接的探测。在30s到120s的激光处理后，ICG和Au-PSMA-ICG纳米棒均表现出荧光性（信息支持，图S10）。通过造影剂（甲苯胺蓝，TBO）我们可以获得ICG和Au-PSMA-ICG纳米棒的单线态氧的产量（Phi;△），分别为0.112和0.160。从这些结果我们可以总结出Au-PSMA-ICG纳米棒比ICG产生更多的单线态氧，说明Au-PSMA-ICG纳米棒比ICG更好地促进PDT的进行。Au-PSMA-ICG纳米棒之所以可以产生更多的单线态氧可能因为系统交叉的增强，光敏剂三重态的增加或者金属基底导致的光敏剂的耐光性增强。
我们也测试了温度如何随光照时间变化而变化。因为Au-PSMA纳米棒和Au-PSMA-ICG纳米棒的存在，波长为808nm的近红外光的照射时间与其感应温度成一个函数关系。Au-PSMA-ICG纳米棒在照射1分钟后温度迅速上至46℃。需要注意的是，当肿瘤细胞的温度超过42-48℃便会死亡。Au-PSMA纳米棒的温度-光照时间曲线的形状与Au-PSMA-ICG纳米棒相似，但是温度都较小。对照组中，水的温度在光照后没有明显升高。因此我们可以发现Au-PSMA-ICG纳米棒不仅比ICG产生更多的单线态氧，同时可以作为更有效的热疗剂。
为了更好地理解图2所展示的光裂解的效果，我们将总荧光强度除以对照组的荧光强度，由此得出细胞存活率（%），激光光斑用虚线圈表示，数据表示为均值标准偏差，它们的统计差异由学生的试验估值。对照组的细胞均未受到任何处理，仅在相同发射功率的近红外和相同的照明条件。在对照组中，没有用纳米棒处理的A549细胞在光照下没有出现任何损害。但是用ICG和Au-PSMA-ICG纳米棒处理的细胞在2分钟的近红外照射后生存率分别降到69.4%和55.4%（plt;0.0001）。
图3.用ICG-AbEGFR、Au-PSMA-纳米棒-AbEGFR和Au-PSMA-ICG纳米棒-AbEGFR处理的A549细胞在能量密度为22.5W/cm2的近红外光照射后存活率。金纳米棒的用量是5*1011。游离的ICG和Au-PSMA纳米棒的量固定在2.334*10-4m。
在三分钟后生存率将至8.3%和2%（plt;0.0001）。然而用Au-PSMA纳米棒处理的细胞在光照2分钟和3分钟后的存活率分别为92.6%和69%。由此可见Au-PSMA-ICG纳米棒比ICG和Au-PSMA纳米棒更有效地杀死癌细胞。我们利用公式PAdditive=(fA * fB)P0来简单计算PDT与光热的叠加效果，式中，PAdditive为照射后最终的细胞数量，P0为初始的细胞数量，fA 和fB分别为PDT和光热处理后的细胞存活率。我们计算在光照2分钟和3分钟后的结果分别为65.6%和5.9%。用Au-PSMA-ICG纳米棒处理的细胞的存活率在统计意义上比我们预测的结果要低，显然，Au-PSMA-ICG纳米棒具有额外的治疗效能。结果表明Au-PSMA-ICG纳米棒可以同时促进PDT和光热的进行，结合PDT和光热更有效地消灭癌细胞，同时提高光裂解效率。
整合Au-PSMA-ICG纳米棒、多通道与高热显像剂，PDT和光学成像的有点，其在癌症诊断治疗、目标分子成像和监视治疗效果中有巨大的潜力。因为激发ICG的波长和ICG发射的光的波长均在近红外区（激发光为808nm，发射为820nm），可以避开了血液和组织等比较透明的介质，并将培育背景的干扰降到最低，可以作为造影剂适用于生物医学成像。图4展示了用ICG-AbEGFR和Au-PSMA-ICG纳米棒-AbEGFR处理的A549细胞。
图4.a)没有ICG处理和光照b)有ICG处理但没有光照c)有Au-PSMA-ICG纳米棒处理但没有光照d)有ICG和光照处理e)有Au-PSMA-ICG纳米棒和光照处理后的A549细胞的激光扫描共聚焦图。金纳米棒的用量是5*1011。游离的ICG和Au-PSMA纳米棒的量固定在2.334*10-4m。细胞用DAPI（蓝）处理。比例尺：20mm。
用ICG-AbEGFR和Au-PSMA-ICG纳米棒-AbEGFR处理但没有光照的A549细胞可以说明ICG-AbEGFR和Au-PSMA-ICG纳米棒-AbEGFR都被细胞吸收并且在细胞质内发出荧光。尽管金对荧光有猝灭作用，但同时存在一中金属增强荧光（MEF）现象。但弱荧光团接近富有自由电子的金属时，比如惰性金属，其量子产率和耐光性会显著增强。在这种情况下，激发状态的荧光团会像震荡偶极子一样与惰
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