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含有胆汁盐的脂质体作为他克莫司（FK506）的新型眼部递送系统：体外表征和改善角膜渗透
摘要：本研究的目的是研究含有胆汁盐的脂质体作为眼科输送系统用于他克莫司改善角膜通透性的潜力。含有胆汁盐的脂质体，包括牛磺胆酸钠，脱氧胆酸钠和甘胆酸钠，通过薄膜分散法制备，这种方法制得的脂质体粒径约为100nm，包封率大于90％。从常规脂质体和含有牛磺胆酸钠，脱氧胆酸钠或甘胆酸钠的脂质体中经12小时释放小于5％的他克莫司。常规脂质体的细胞吸收显着高于含有胆汁盐的脂质体。然而，与常规脂质体相比，含有胆汁盐的脂质体在他克莫司的离体角膜转运中使他克莫司增加3-4倍。当兔眼用含DiI-高氯酸盐的脂质体悬浮液处理时，含有胆汁盐的脂质体在角膜显示快速持久的穿透效果。不幸的是，含有脱氧胆酸钠的脂质体对自发产生的角膜上皮细胞和兔角膜造成毒性或刺激。因此，低毒性和渗透性较好的含有牛磺胆酸钠和甘胆胆酸钠的脂质体是眼药物递送系统中的潜在载体。
关键词：脂质体，胆汁盐，他克莫司，角膜，牛磺胆酸钠，脱氧胆酸钠，甘胆酸钠
介绍
角膜移植在所有类型的器官和组织移植中的成功率最高，尽管免疫排斥仍然是移植物衰竭的主要因素。免疫抑制剂如环孢菌素A和他克莫司（FK506）的药物治疗是使用的主要策略以抑制免疫排斥。FK506是一种通过从链霉菌（Streptomyces tsukubaensis）发酵分离的新型免疫抑制剂，与环孢菌素A类似，但效果更好（达到环孢菌素A的100倍）。临床研究表明，局部传递的FK506能够抑制高风险角膜和角膜移植后的免疫排斥反应。然而，FK506由于水溶性差（1.3mu;g/ mL）和较高分子量（804.02g / mol）而难以穿透角膜上皮并积聚在角膜基质中。因此在抑制角膜移植后的免疫排斥反应方面，滴眼液较眼内剂量制剂而言是个更好的选择。已经报道了他克莫司悬浮液和油剂的形式的眼药水。
尽管滴眼剂具有明显的优点，例如易于给药和良好的顺应性，但角膜上的生理屏障导致药物分子的吸收差，因此局部使用时疗效差。这些约束包括角膜渗透不良，被眼泪和鼻泪管消除，并通过其他吸收途径输送到全身循环中。同时，悬浮液和油剂两者的生物相容性差，呈现强刺激性。因此，提高角膜渗透性并延长角膜前的保留时间是设计制剂时需要考虑的关键方面。纳米药物递送系统，例如纳米颗粒，分散体，纳米乳剂和脂质体已显示改善角膜穿透并增加保留时间的优点。脂质体由于与生物膜相似，具有更好的生物相容性。以前的研究表明，装载FK506的脂质体可以促进药物穿透角膜进入房水，并且药物将分散在整个眼组织中，类似于FK506的橄榄油溶液。然而，被吸收的脂质体FK506仍然太小，无法达到治疗水平，因此FK506的转角膜渗透需要改善。
用胆汁盐代替脂质体中胆固醇的一部分使得脂质体变得更加柔软，这可以促进载体穿过生物膜的渗透。最近的报道表明，与常规脂质体相比，含有胆汁盐的脂质体可改善药物分子的口服和透皮吸收。用于药物输送系统的刺激性较小的胆盐主要包括甘胆酸钠，脱氧胆酸钠和牛磺胆酸钠。
在本研究中，制备了含有三种胆汁盐（甘胆酸钠，脱氧胆酸钠或牛磺胆酸钠）的他克莫司的脂质体，并在体外表征。在使用切除的角膜的离体扩散细胞模型中，评价角膜渗透性。此外，我们使用人工培养的人角膜上皮细胞（SDHCECs）评估含有胆汁盐的脂质体的摄取和毒性，以评估其眼部应用的潜力。最后，在将兔脂质体给予兔眼后，评估体内摄取和毒性
材料和方法
材料
他克莫司购自上海拜博生物技术公司（中国上海市）。甘氨胆酸钠购自Amresco（Solon，OH，USA）。大豆磷脂酰胆碱（S100）和胆固醇由Lipoid（Lipoid GmbH，Ludwigshafen，Germany）提供。牛磺胆酸钠和脱氧胆酸钠从Sigma（St Louis，MO，USA）获得。Sephadex G-25购自Pharmacia（Peapack，NJ，USA）。DiI-高氯酸盐（1,1-二十八烷基-3,3，3-四甲基 - 多碳羰花青高氯酸盐）得自泛博生化（中国上海市）。高效液相色谱级乙腈和甲醇购自Tedia Company Inc（Fairfield，CA，USA）。甲基噻唑基联苯四氮唑（MTT）由Sigma提供。所有其他试剂均为分析纯。
含有他克莫司的含有胆汁盐的脂质体的制备
使用薄膜分散法制备含有胆汁盐的他克莫司脂质体。简言之，将大豆磷脂酰胆碱，胆汁盐（甘胆酸钠，牛磺胆酸钠和脱氧胆酸钠）和他克莫司溶于二氯甲烷/甲醇（9:1，v / v）在圆底烧瓶中。然后使用旋转蒸发器（RV 10 digital，IKA Works，Staufen，Germany）在37℃水浴中真空除去有机溶剂。将干燥的脂质膜在减压下保持2小时以除去剩量的溶剂。然后将脂质膜与10ml磷酸盐缓冲液（pH7.4）在37℃下水合30分钟，得到脂质体的粗分散体。使用探针超声波仪（Scientz-IID，Ningbo Scientz Biotechnology Co，Zhejiang，中华人民共和国）进一步降低脂质体的粒径。将脂质体分散体储存在4℃备用。按该操作方法，使用胆固醇代替胆汁盐来制备常规脂质体。
脂质体的表征
粒度和Zeta电位
通过使用Nano ZS Zeta电位分析仪（Malvern，Worcestershire，UK）在25℃下通过动态光散射测定加入他克莫司的脂质体的粒径和Zeta电位。进行三次测量，每次测量中的运行次数由软件自动确定; 结果表示为平均值plusmn;标准偏差。
透射电子显微镜
使用透射电子显微镜（JEM-1230，JEOL，Tokyo，Japan）观察脂质体的形态。将一滴脂质体悬浮液转移到300目的覆盖有碳加强火棉胶支持膜的电镜铜网上，并通过印压除去额外的水。加入一滴2％乙酸铀酰60秒以染色脂质体，并将悬浮液在环境条件下干燥。在120kV的加速电压下检查样品。
包封率
使用凝胶渗透色谱法测定他克莫司在脂质体中的包封率。简单来说，用200mu;L空白脂质体洗脱填充有Sephadex G-25凝胶的柱（20cmtimes;1cm）以使色谱柱饱和并提高色谱柱回收率。随后，将含他克莫司的脂质体，用水以1mL /分钟的流速洗脱，以将游离他克莫司与脂质体分离。使用分光光度计（UV-2401，Shimadzu，Tokyo，Japan）通过使用分光光度计（UV-2401，Shimadzu，Tokyo，Japan）测量波长为500nm的浊度来监测洗脱。将含有洗脱液的脂质体溶解在甲醇中，并通过紫外线高效液相色谱法分析他克莫司。包封率（EE％）计算为：EE％= Wliposome / Wtotal，其中Wlipsome和Wtotal表示脂质体中他克莫司的重量和总体他克莫司的重量。
体外释放
使用动态透析研究了含他克莫司的脂质体的体外释放曲线。新鲜制备的模拟泪液的模拟介质，用100mL去离子水溶解NaCl（0.67g），NaHCO 3（0.20g）和CaCl 2·2H 2 O（0.008g）的组合物。释放介质含有0.1％的十二烷基硫酸钠盐以达到水槽条件。开始时，将1mL脂质体（他克莫司3mg / mL）转移到具有100kDa膜分子量截留值的透析管（Float-A-Lyzerreg;G2，Spectrum Laboratories，Torrance，CA，USA）中，然后将其放置放入100mL释放介质中，在34℃plusmn;0.5℃以100rpm的速度搅拌。 在预定的时间间隔，将1mL释放介质取出，并加入等体积的新鲜释放介质，以保持恒定的体积。 通过紫外线高效液相色谱法（10000times;g，5分钟）测定他克莫司含量。
使用SDHCECs进行细胞毒性检测
细胞培养
在37℃，5％CO2/95％空气条件中，40〜60代的SDHCEC作为单层生长，并显示超过97％存活率的细胞可实验使用。 所使用的培养基是Dulbecco改良的Eagle培养基，补充10％热灭活的胎牛血清，10ng / mL人表皮生长因子，5mu;g/ mL胰岛素-人转铁蛋白-硒，0.4mu;g/ mL氢化可的松，2mML-谷氨酰胺，100U / mL青霉素和100mu;g/ mL链霉素（均来自Gibco，Grand Island，NY，USA）。
细胞毒性
通过MTT测量SDHCEC的活性，以评估含有胆汁盐的脂质体的细胞毒性。将大约1times;104个细胞（200mu;L细胞培养基，5times;104个细胞/ mL）接种在96孔组织培养板中。 然后在用于细胞培养的相同条件下培养细胞超过24h。 在实验前除去培养基，并将200mu;L无补充培养基中的脂质体作为阴性对照加入每个孔中。10小时后，向每个孔中加入20mu;L（5mg / mL） MTT溶液，2小时后除去培养基。 然后将所得的甲瓒溶解在150mu;L二甲基亚砜中，并在570nm测量吸光度。
细胞吸收
将SDHCEC以密度3times;104个细胞/孔接种在24孔板中，并孵育24小时使其粘附。为了量化由细胞摄取的他克莫司的脂质体，将SDHCEC与无补充培养基中的他克莫司负载的脂质体在不同时间段（2，4，8和12小时）下孵育。用磷酸盐缓冲盐水（pH7.4）洗涤细胞三次后，加入200mu;L磷酸盐缓冲盐水，并将细胞悬浮液冻融。将冻融的细胞悬浮液（100mu;L）用100mu;L甲醇涡旋5分钟，并以10000times;g离心10分钟。通过高效液相色谱串联质谱法测定上清液中的药物浓度，使用二喹啉酸测定试剂（西塘生物技术有限公司，中国上海市）测定细胞悬浮液中的蛋白质含量。他克莫司的细胞摄取计算方法为：药物摄取（ng /mu;g蛋白）= CTLM / C蛋白，其中CTLM是他克莫司的细胞内浓度，C蛋白是细胞蛋白的浓度。
离体兔转运角膜
使用扩散面积为0.825cm2的Valia-Chien扩散池进行离体角膜穿透研究。复旦大学实验动物服务中心获得重量为2.0-2.5公斤的新西兰白兔。所有动物治疗均符合关于实验动物管理事项的规定，经复旦大学动物伦理委员会批准。兔子在用过量的20mg / kg赛拉嗪和氯胺酮200mg / kg的肌肉麻醉混合物麻醉后，通过将过量的空气注射到边缘耳静脉中来安乐死。将角膜从球体切除并安装在灌注装置的环上。用盐水轻轻冲洗角膜，在安装前非常小心不要在膜上产生皱纹或折叠。将预热至34℃的模拟泪液（3mL）放入装置的受体室中，在整个实验中进行磁力搅拌。三毫升脂质体（含1mg / mL他克莫司）放置在供体室中，然后将其密封以避免蒸发。将O2：CO2（95：5）的混合物通过鼓泡室。根据前面报道的方法测量角膜水化水平，指示角膜状况。
接下来，在30，60，90，120，180和240分钟取500mu;L样品，并用新鲜的模拟泪液代替。通过高效液相色谱串联质谱法测定透过角膜的药物量。
通过角膜上皮渗透的药物的量相对于每个脂质体的时间作图，并且计算图的线性部分的斜率。角膜渗透系数（cm / s）根据下式确定：
P =Delta;Q/Delta;t·C·A·60，其中Delta;Q/Delta;t是斜率的线性部分（mu;g/分钟），60是从分钟到秒的转换常数，A是角膜表面积， C0是初始药物浓度（mu;g/ cm3）。
体内角膜摄取
使用荧光标记的冷冻切片评估体内角膜摄取脂质体。通过加入指定量的DiI-高氯酸盐来标记脂质体制剂，然后通过与用于制备含有他克莫司的脂质体相同的方法进行加工。将兔随机分为4组，每组3只，每只接受40mu;L含有50mu;g/ mL DiI高氯酸盐的脂质体。滴注10,30和60分钟后，将来自每组的一只兔子进行安乐死，将角膜从球体中切下，并用盐水轻轻冲洗。一只兔子不作处理作为阴性对照进行治疗。将角膜通过浸入Davidson溶液中固定4小时，然后在30％蔗糖中固定脱水过夜。接下来，将角膜嵌入最佳切割温度复合物（Tissue-Tekreg;，Sakura，Torrance，CA，USA），在-22℃下冷冻，切成5mu;m切片，并在共聚焦扫描激光显微镜（LSM 510 Meta ，蔡司，Oberkochen，德国）。
体内角膜耐受试验
在苏木精和伊红染色后的石蜡部分评估体内角膜耐受性。将兔随机分为5组，每组3只，每只兔子右眼以30分钟间隔接受40mu;L含有1mg / mL他克莫司的脂质体，每30分钟/次，6小时。对侧眼为对照组，未接受治疗。第十六只动物未经治疗，作为假手术对照。第一次滴注6小时后，将兔子安乐死，将角膜从眼球上切下，用盐水轻轻冲洗。将角膜浸入Davidson溶液中1小时，并用10％中性福尔马林固定。随后，将它们在醇梯度脱水，置于熔融的石蜡中，并固化成块状。切片切片，用苏木精和伊红染色，观察显微镜观察病理改变。
他克莫司的测定
采用LC-10 ATvp反相紫外线高压液相色谱法（Shimadzu，Kyoto，Japan）测定他克莫司含量，该方法如前所述。该系统由二元泵，可调紫外检测器，柱式加热器和手动进样器组成。
流动相是乙腈/0.1%磷酸溶液（65/35，v / v）的混合物，1.0mL/min流速。将他克莫司在C18柱（Eclipse XDB，4.6times;50mm，5mu;m，Agilent Te
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