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蜡菊属植物化学成分的提取分离及其体外抗氧化活性研究
Olayinka A Aiyegoro和Anthony I Okoh
摘要：
背景：由于自由基在体内的积累造成了许多与氧化应激有关的疾病。现在在世界范围内大家都在研究寻找天然抗氧化剂的植物来源。这个研究的目的旨在评估蜡菊属植物[菊科]体外抗氧化活性并提取分离其化学成分菊油提取物。
方法：我们评估了蜡菊粗提的水提取物的抗氧化潜力和其化学成分中涉及抑制超氧化物阴离子、DPPH、H 2 O 2、NO和ABTS的测试。提取物中的类黄酮、原花青素和酚类物质也用标准植物化学反应测定方法进行评估。
结果：植物化学分析显示有单宁、类黄酮、类固醇和皂苷的存在。水提取物的酚含量为0.499毫克没食子酸当量/克提取物粉末。植物黄酮类和原花青素含量分别为0.705和0.005毫克没食子酸当量/克提取物粉末。在氧化初期脂质过氧化物的抑制百分比显示抗氧化剂BHT（84.6％）和没食子酸（96％）的活性为87％。另外，抑制百分比丙二醛通过提取物显示出与BHT（72.24％）和Gallic（94.82％）相当的百分比抑制率为78％。
结论：我们的研究结果提供证据表明蜡菊粗提水提取物是潜在的天然抗氧化剂来源，这证明其在民俗药物中的用途。
背景
活细胞作为生理和生化过程的结果，可能产生自由基和其他活性氧副产物。自由基可以引起脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，最终导致许多慢性疾病，如癌症、糖尿病、衰老和其他退行性疾病[1]。植物具有自由基清除分子，如维生素、萜类化合物、酚酸、木质素、二苯乙烯、单宁、类黄酮、醌、香豆素、生物碱、胺、甜菜碱和其他代谢物，它们具有丰富的抗氧化活性[2,3]。研究表明，这些抗氧化剂具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗诱变、抗癌、抗菌和抗病毒活性[4,5]。降低癌症、心血管疾病、糖尿病以及与衰老有关的其他疾病风险与天然抗氧化剂的摄入有关[6,7]，近年来世界范围内使用天然植物化学物质的趋势正在上升，目前主要集中为浆果作物、茶叶、草药、油籽、豆类、水果和蔬菜等[8-10]。
蜡菊属，属于菊科，其中包括有600余种植物。这个名字源于希腊语helisso（转身）和chrysos（金），别名又叫“麦秆菊”。其主要分布在非洲（南非有244种），马达加斯加，大洋洲和欧亚大陆。该植物是一年生草本多年生植物或灌木，生长到90厘米的高度（http://en.wikipedia.org/wiki/Strawflower）。 蜡菊属植物物种被广泛用于包皮环切术、瘀伤、切口和溃疡中，通常作为伤口的敷料和治疗一些相关疾病[11,12]。 所含的许多不同化合物如酚类等、类黄酮和查尔酮、苯酞、alpha;-吡喃衍生物、萜类化合物、精油、挥发物和脂肪酸已被发现[13]。
蜡菊叶被“Pondos”用于治疗包皮环切伤。叶片经加热至过热的灰分，然后用作绷带治疗割伤后的伤口[11]。在南非部落的说法中，割礼不仅仅是手术，这是男人与男孩分离的文化仪式。传统上，包皮环切引起的伤口是由Helichrysum pedunculatum Hilliard＆Burtt、H. appendiculatum Hilliard＆Burtt或蜡菊属（菊科）的捣碎的叶子包扎起来的。然而，传统的割礼有很高的感染风险。关于蜡菊属的信息在可利用的文献中很少，因此表明对该物种的抗氧化潜力没有做太多的工作。 蜡菊属植物是一种具有潜在的化学化合物来源的植物[11,14]。植物化学研究表明，植物富含类黄酮和其他水溶性多酚类化合物[12]。虽然蜡菊提取物的抗菌潜力以前已经由我们的研究组[15,16]做过研究和报告。但本研究确实对蜡菊属植物的植物化学成分、体外抗氧化和自由基清除潜力等不同方向进行研究。
方法
植物材料
2007年12月，从南非东开普省基德海滩的一个农场收集了蜡菊。 将植物材料与早期从同一地点收集的凭证样本进行比较，并存放在爱丽丝堡大学植物科学大楼的格里芬植物标本馆;标本馆编号为AYK / 2007 / HL / 2。 植物材料后来被标本馆的负责人确认为植物蜡菊。挑取叶子并用水洗涤以除去所有不需要的植物材料和沙子，在曝光（27℃-30℃，7天）下空气干燥，使用研磨机(CHRISTY LAB MILL, Christy and Norris Ltd; Process Engineers, Chelmsford, England)磨碎，并储存在密封的容器中供进一步使用。
提取物的制备
粉碎的植物材料（200g）在振荡器（Stuart Scientific Orbital Shaker，UK）上的蒸馏水（5.5L; 27℃-30℃）中萃取三次共48小时。 使用布氏漏斗和Whatman No.1滤纸过滤提取物。 将得到的水提取物的滤液在-40℃下快速冷冻，并使用冷冻干燥机（Savant Refrigerated vapor Trap，RV T41404，USA）干燥48小时，得到30g干提取物。所得萃取液用蒸馏水重构，得到本研究中使用的所需浓度。
化学制品
所有化学品纯度最高（ge;99.0％）。 氯化铁、HCl、Dragendorff试剂、镁金属条、甲醇、没食子酸、商业皂苷（购自BDH，England，来自Biolab，South Africa）、氯仿、H 2 SO 4、Folin-Ciocalteu试剂、Na 2 CO 3、香草醛、氯化铝、乙酸钾、磷酸盐缓冲液、K3Fe（CN）6、三氯乙酸（TCA）、2-硫代巴比妥酸（TBA）、硫氰酸盐（FTC）、丁基化羟基甲苯（BHT）、2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、2,2-亚氨基 - 双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、过硫酸钾、硝普钠、过氧化氢、对氨基苯磺酸、冰醋酸、萘乙二胺二氯化物、偏亚硫酸氢钾（PMS）、NADH均为 从美国默克购买。
植物提取物的植物化学筛选
根据[17,18]的方法，小部分干提取物用于包括单宁、类黄酮、生物碱、皂苷和类固醇的化合物的植物化学测试，几乎没有修改。将1.0g的植物提取物完全溶解在10ml蒸馏水中并过滤（使用Whatman No 1滤纸）将由氯化铁试剂加入滤液得到的蓝色着色指示提取物中存在单宁。将0.5g的植物提取物完全溶于5ml蒸气浴中的1％HCl中。用几滴Dragendorff试剂处理一毫升滤液。将浊度或沉淀作为生物碱的存在的指示。将约0.2g提取物溶于2ml甲醇中并加热。向混合物中加入镁金属片，然后加入几滴浓HCl。红色或橙色着色的发生表明黄酮类化合物。使用新鲜制备的7％血琼脂平板，并在其中制备孔。将溶解在10％甲醇中的粗提取物用于填充在琼脂平板上钻孔的孔。使用10％甲醇作为阴性对照，商品皂苷溶液用作阳性对照。将板在35℃温育6小时。提取物周围的血液完全溶血是皂角苷的指示。将约0.5g提取物溶于3ml氯仿中并过滤。将浓缩的H 2 SO 4小心地加入到滤液中以形成下层。界面处的红棕色被认为是类固醇环的阳性。
总苯酚的测定
使用Folan-Ciocalteu试剂，使用由作物研究所报告[19]修改的Spanos [16]的方法测定蜡菊水提取物中苯酚的量。 将2.5ml 10％Folin-Ciocalteu试剂和2ml Na 2 CO 3（2％w / v）加入0.5ml每种样品（3次重复）植物提取物溶液（1mg / ml）中。 将所得混合物在45℃下振荡孵育15分钟。 使用UV /可见光在765nm处测量样品的吸光度。结果表示为溶解在蒸馏水中的毫克没食子酸（0-0.5mg / ml）。
总黄酮的估计
使用氯化铝比色法测定黄酮。 将1ml样品（1mg / ml）与3ml甲醇，0.2ml 10％氯化铝，0.2ml 1M乙酸钾和5.6ml蒸馏水混合，并在室温下保持30分钟。 用紫外可见分光光度计测定反应混合物的吸光度为420nm。 通过在蒸馏水中制备没食子酸溶液（0-0.8mg / ml）制备的校准曲线的外推法测定含量。 黄酮的浓度用mg / ml表示。
总原花青素的测定
根据Sun等人的方法确定总原花青素[20]。 将3ml香草醛 - 甲醇（4％v / v），1.5ml盐酸的混合物加入到0.5ml（1mg / ml）水提取物中并涡旋。 将所得混合物在室温下静置15分钟，然后测量500nm处的吸光度。 总原花青素含量从标准曲线表示为没食子酸当量（mg / ml）。
还原力的测定
根据Oyaizu [21]的方法评价提取物的还原力。 将含有2.5ml 0.2M磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2.5ml K3Fe（CN）6（1％w / v）的混合物加入溶于蒸馏水的1.0ml提取物中。 将所得混合物在50℃下孵育20分钟，然后加入2.5ml TCA（10％w / v）。 将混合物以3000rpm离心10分钟以收集上层溶液（2.5ml），与蒸馏水（2.5ml）和0.5ml FeCl 3（0.1％，w / v）混合。 然后在700nm处对空白样品测量吸光度。
抗氧化测定
使用硫氰酸铁（FTC）和硫代巴比妥酸（TBA）方法测定含水植物提取物的抗氧化活性。 使用FTC方法测量过氧化物开始时的过氧化物量，而TBA法用于测量过氧化物氧化后存在的自由基。
硫氰酸铁（FTC）法
由Kikuzaki等人描述的标准方法[22]用于FTC测定。将4mg样品（终浓度为0.02％w / v）的4ml 99.5％乙醇，4.1ml 2.51％亚油酸在99.5％乙醇中的混合物，8.0ml 0.02M磷酸盐缓冲液（pH7.0）和3.9将包含在螺旋盖小瓶（Oslash;38times;75mm）中的ml蒸馏水置于40℃的黑暗中的烘箱中。为了测量抗氧化活性的程度，将0.1ml反应混合物转移到试管（Oslash;38times;150mm）中，加入9.7ml 75％（v / v）乙醇水溶液，然后加入0.1ml 30％硫氰酸铵水溶液和0.1ml 0.02M氯化亚铁的3.5％盐酸溶液。在向反应混合物中加入氯化亚铁三分钟后，每24小时测量所得混合物的吸光度（红色），直到对照的吸光度达到最大值。使用丁基化羟基甲苯（BHT）（终浓度为0.02％w / v）作为阳性对照，而没有植物提取物的混合物用作阴性对照。
硫代巴比妥酸（TBA）法
由Kikuzaki和Nakatani [24]修改的Ottolenghi [23]的方法用于测定含水叶提取物中存在的自由基。 使用从FTC测定制备的相同样品中的最终样品浓度为0.02％w / v。将两毫升20％三氯乙酸和2ml 0.67％硫代巴比妥酸加入到来自FTC方法的1ml样品溶液中。 将混合物置于沸水浴中10分钟，然后在3000rpm冷却20分钟后离心。 在552nm处测量上清液的吸光度，并在其达到最大值后记录。
2,2-二苯基-1-辛基肼（DPPH）测定
Liyana-Pathiana和Shahidi [25]的方法用于测定DPPH自由基的清除活性。 将1ml在甲醇中制备的0.135mM DPPH与1.0ml 0.2-0.8mg / ml的水提取物混合。 将反应混合物充分涡旋并在室温下保持暗色30分钟。 在517nm处用分光光度法测定吸光度。 使用该方程计算植物提取物的清除能力;
DPPH清除活性(%)= [(Abs对照minus; Abs样品)]/(Abs对照)] times;100
其中Abs对照是DPPH 甲醇的吸光度; Abs样品是DPPH自由基 样品的吸光度（即提取物或标准品）
2，2-氮杂双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）清除活性
Re等人的方法 [26]用于测定植物提取物的ABTS活性。通过将7mM ABTS溶液和2.4mM过硫酸钾溶液的两种储备溶液相等量混合制备工作溶液，并在室温下反应12小时 在黑暗中。 随后通过混合1ml新鲜制备的ABTS 溶液稀释所得溶液，随后在7分钟后测量734nm处的吸光度。 计算提取物ABTS 的清除抑制能力百分比，并与丁基化羟基甲苯（BHT）进行比较。提取物的ABTS 的清除抑制能力百分比由下式计算：
抑制率（%）=[（Abs对照-Abs样品）] /（Abs对照）] times;100
一氧化氮清除活性
采用Garratt [27]的方法，测定蜡菊水提取物的一氧化氮自由基清除活性。硝普钠在生理pH水溶液中自发产生一氧化氮，与氧相互作用，产生通过使用Griess试剂测定的亚硝酸根离子。将溶解在0.5ml磷酸盐缓冲盐水（pH7.4）中的2ml 10mM硝普钠溶液与0.5ml不同浓度（0.2-0.8mg / ml）的植物提取物混合。将混合物在25℃下温育。 150分钟后，取出0.5ml温育溶液，与0.5ml Griess试剂[（1.0ml对氨基苯甲酸试剂（在20％冰醋酸中0.33％，室温下为0.33％，用1ml萘乙二胺二氯化物（0.1％ w / v）]，混合物在室温下孵育30分钟，在540nm处测量吸光度，按照下式计算一氧化氮根的
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