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石蒜中加蓝他敏的浓缩和辅酶的提取
摘要：为了探究通过正交设计和阳离子交换的方法从石蒜中完全提取出加蓝他敏的辅酶的最佳条件。方法：纤维素和果胶酶溶液常常作为分离的溶剂。我们要调查的是酶的ph，多种酶的数量，分离时间，酶水解温度对分离结果的影响。结果：获得的最佳条件如下：固液比1：10，ph值4.5，各种酶占4%，酶水解温度为50℃，反应时间为2小时。在这些条件下，加蓝他敏的分离率是0.0294%。而且，我们选用阳离子交换树脂来分离加兰他敏。试剂ph为2的吸附率为3BV/h，用含1.5mol/L氨水的70%乙醇作为洗脱剂的脱吸率为3BV/h。分离后，加蓝他敏的含量增加了12.31%，结论：这个结果为工业生产加蓝他敏提供了参考。
关键词：离子交换树脂；辅酶提取；加蓝他敏；石蒜；分离
- 简介
石蒜，草本植物，又称彼岸花，是一种多年生的石蒜科植物，多生长在东亚，尤其是韩国，中国东部和南部地区，日本也有一些[1]，石蒜科植物大都可以产出独特有生物活性的生物碱，比如，抑制性乙酰胆碱酯酶，止疼剂，抗菌药，抗癌药，抗病毒活性等等[2]。尤其是，加蓝他敏表现出的对感知意识欠缺的老鼠和兔子的治愈作用，这也是阿兹海默症的症状[3]。我们已经改进了一些从石蒜科植物中获取有机物的提取方法，比如溶剂提取，超声波提取，电磁波提取，超临界流体提取等等[4]。最早用化学方法全合成加兰他敏的工作始于上世纪60年代初，当时D Barton 用9步合成工艺制备了外消旋的加兰他敏，总收率仅0.07%。目前的合成方法中总收率已大大提高，可用于工业化生产。石蒜属( Lycoris radiata)植物鳞茎主要含有加兰他敏、石蒜碱、石蒜胺碱、伪石蒜碱等生物碱。加兰他敏是一种乙酰胆碱酯酶可逆竞争性抑制剂,近年来被应用于治疗阿尔茨海默氏型痴呆症(AD)的中轻 度认知障碍,效果显著。加兰他敏有两种旋光异构体, 分为左旋和右旋加兰他敏两种,目前植物中提取的为左旋加兰他敏,并且在欧洲和美国已经作为临床药物.据已有研究,右旋加兰他敏也具有抑制乙酰胆碱酯酶的活性,但大多是经过繁琐的化学合成,成本与提取的加兰他敏相比,不相上下,甚至略高。肖观秀等用粉碎预处理和超声波强化法预处理石蒜鳞茎,然后用超临界流体法提取加兰他敏,这种方法得到加兰他敏成本昂贵,不利于工业化大量生产.范华均等采用微波辐射溶剂回流提取法提取石蒜中的加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏生物碱,微波辐射虽能破碎鳞茎细胞,使生物碱充分释放,但同时也将石蒜中的糖类、脂类释放,这样会加大对浸膏的处理难度, 也加大成本。奥地利维也纳大学的Froehlich教授以 3,4-二甲氧基苯甲醛为起始原料，经9步反应，得到(-)加兰他敏，总收率 18%。采用该工艺，生产规模可超过2t/a。加兰他敏（Galanthamine base）是一种天然活性生物碱，临床广泛用于阿尔茨海默病(Alzheimerrsquo;s disease, AD)及重症肌无力等疾病的治疗，药理研究显示，加兰他敏一方面具有 强效的可逆性乙酰胆碱酯酶 (acetylcholi- nesterase,ACh E)抑制活性，另一方面又具有神经元烟碱受体构象调节作用，因而较其他胆碱酯酶抑制剂如他克林(tacrine)等具有更好的疗效及安全性，应用前景十分广阔
然而，由于这些方法有许多弊端，例如浪费大量有机溶剂，成本高，并且提取率低，最近，辅酶提取法由于它的高效，条件温和，无污染受到广泛关注，根据Purietal（2012）像纤维素水解酶，纤维质酵素和果胶酶通过它组分水解来分离细胞壁，碳水化合物水解酶决定着主要的通透率和有利于植物代谢物更加容易排泄。直到现在，都没有关于从石蒜中提取加蓝他敏过程中碳水化合物水解酶利用率的报道，我们也尝试过用阳离子交换树脂来提高加蓝他敏的分离效率。然而，这项技术从来都没有运用到加蓝他敏的分离中[5]。
目前的研究中，为了提高加蓝他敏的提取效率和发展一个更加绿色的提取方法，我们通过反应和提取因素来测试辅酶提取法，比如酶的类型，酶的比例，反应温度，ph值，时间和固液比。另外，我们也研究阳离子交换树脂法分离加兰他敏.
- 原料和方法
2.1原料和工具
我们从中国湖南怀化收集了石蒜的鳞茎，由吉首大学的植物分类专家Boru Liao进行植物学认证。
国际食品药品管理机构规定加蓝他敏的纯度要在98%以上。从Baimai Green Bio-engergy Co，ltd购得纤维素酶。半纤维素酶和果胶酶是从上海的公司进货。阳离子交换色谱732，HD-8,HZ-008,D155,D001和D152都是从郑州取得的。所有的有机溶剂都是分析级的，除了HPLC。
HPLC用于加蓝他敏的测定。Vacuum Freeze Dryer FD5-3用于干燥
2.2 方法
2.2.1 酶的类型的选择
把试算的鳞茎洗干净然后干燥，研碎。对于辅酶的提取而言，ph4.5，固液比1：10时，鳞茎粉末悬浮在水中。然后，用3%的酶制剂比如纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，纤维素和半纤维素没的混合物，纤维素酶和果胶酶的混合物，半纤维素酶和果胶酶的混合物，和三者的混合物，分别加入到鳞茎粉末中。然后在50℃下，样品培养2小时。随后，将培养基在5000r/min小离心20min。取上清液于50毫升容量瓶中，稀释至刻度，ph约4.5.获得的溶液用0.45mu;m的滤膜过滤，再用HPLC分析加兰他敏的含量。所有步骤重复3次。
2.2.2 单元素实验
分析纤维素酶和果胶酶的混合物。酶的反应变量为底物浓度从0-5%，溶剂ph1.5-7.5，反应温度20-80℃，反应时间0.5-2.5小时，另外还需要测试固液比从1:5-1:25，所有的测定都用3倍的量进行。
2.2.3 正交实验
在单因素实验的基础上进行正交试验。四个酶的变量包括底物比例，ph，温度，时间作为正交排列一起测定。
2.2.4 HPLC分析石蒜中的加兰他敏
在用酶处理来测定从石蒜中提取辅酶过程中加兰他敏的释放前后，都要用HPLC分析样品。20mu;L的样品注入到反相HPLC，流动相用17%甲基氰和83%的磷酸盐缓冲液，35℃在290nm下监测。磷酸盐缓冲液用2.72g的砷酸二氢钾磷酸盐溶于100ml加1.4ml的三乙胺的水中，用水稀释至1L。磷酸盐缓冲液的ph大约是7.02.
2.2.5 加兰他敏的标准曲线
先准备1.0mg/ml的加兰他敏参比溶液。然后将0.05，0.1,0.2,0.5，1.0,2.0,5.0的参比溶液转移到10ml的容量瓶中，得到浓度分别是0.005,0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5的稀释参比溶液。过滤，将滤液注入HPLC，进行加兰他敏含量的测定。回归曲线根据加兰他敏含量的峰值域得到回归方程为y=1038x 39348，r=0.9996.
2.2.6 加兰他敏提取率的计算
用公式y=cv/m0来计算加兰他敏的提取率，式中的c表示加兰他敏的浓度，v式是最后的提取体积，m0是鳞茎粉末的质量。
2.2.7 阳离子交换树脂的选择和色谱条件的优化
我们测试两种阳离子交换树脂的分离效果，包括强酸阳离子交换树脂（732，HD-8H,Z-008）和弱酸离子交换树脂（D155和D152）。
用去离子水浸泡阳离子交换树脂过夜，然后用清水冲洗，直至水澄清。用5BV的5%HCl溶液，5%的NaOH溶液和5%的HCl浸泡树脂足12h。然后用去离子水洗涤，直到ph值为6-7，以获得H 交换树脂。将石蒜的鳞茎提取液以一定的流速载入H 交换树脂中。用含1.5mol/L氨水的70%乙醇做洗脱剂。收集到一定量的溶液，用HPLC分析其中加兰他敏的含量。Ph值，负载流速，洗脱剂类型，负载液的洗脱流速这些分离变量都要研究。
2.2.8 阳离子交换树脂吸附率和脱吸吕率的计算
吸附量=（C0-C1）*V2/W
脱吸率=C2*V2/((C0-C2)*V1)*100%
式中的C0，C1，C2分别表示提取液的浓度，用阳离子交换树脂处理的提取液的浓度和从阳离子交换树脂洗脱出的溶液的浓度，V1,V2表示提取液的量和阳离子交换树脂洗脱的溶液的量。W式树脂的质量（g）。
- 结果与讨论
3.1酶类型的选择
根据表1，采用纤维素酶和果胶酶的混合物有最好的提取效果，提取率达0.0205%。次之的是纤维素酶和半纤维素酶。在单个酶的作用下，加兰他敏不能充分地石蒜的鳞茎中提取出来。根据Ajay et al（2011），果胶酶可以通过果胶的水解作用导致细胞分离，纤维素酶可以逐渐地降解纤维素，也可以降解细胞壁[6]。在给定的提取条件下，纤维素酶和果胶酶产生的协同作用是加兰他敏的提取率增长。因此，在接下来的试验中，我们采用纤维素酶和果胶酶的混合物来进行实验。
3.2单因素实验结果
3.2.1 从石蒜鳞茎中提取加兰他敏过程中反应ph值的影响见表1A。ph为4.5时，加兰他敏的提取率急剧增长，并且达到最大值，ph继续增长到6便急剧下降，在ph为7时达到最小值，这可能是由于反应液对酶构型和底物分离状态的影响。
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表1 不同种类酶作用下加兰他敏的提取结果 |
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酶 |
提取率（%） |
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纤维素酶 |
0.0192 |
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半纤维素酶 |
0.0189 |
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果胶酶 |
0.0185 |
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纤维素酶，半纤维素酶混合物 |
0.0203 |
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纤维素酶，果胶酶混合物 |
0.0205 |
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半纤维素酶，果胶酶混合物 |
0.0191 |
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纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶混合物 |
0.190 |
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不加酶 |
0.179 |
3.2.2 酶对底物比例的影响见图1B。酶和底物的比例在0-3%时，加兰他敏的提取率明显增长，在3%时达到最大值。酶在破碎细胞壁和促进加兰他敏的提取中起重大作用。
3.2.3 反应时间的影响见表1C。加兰他敏的提取率随时间的变化增长，在1.5h时达到最大值，然后随时间缓慢增长。反应开始时，加兰他敏随底物和酶活性浓度逐渐释放。1.5h时，主要的阻力是细胞壁中的纤维素和果胶，细胞间的物质完全分离，则加兰他敏有最大的提取率。因为加兰他敏不稳定，在空气中易氧化，部分加兰他敏可能降解，提取率降低[7]反应时间应控制在1.5h以内。
3.2.4 反应温度的影响见表1D。温度在20-50℃变化时，加兰他敏的提取率显著增长，在50℃时达到最大值，可能是因为高温对酶的活性有抑制作用。
3.2.5 固液比的影响见表1E.加兰他敏的提取率随固液比显著增长，在1:10时达到最大值。低固液比有助于酶和底物的相互作用，但是这增加了反应液的粘性，加兰他敏不能充分渗入[8]会降低反应液的粘性，加速主要的转化进程。然而，酶和底物的反应记录相应的会被影响。因此，在适当的固液比下，加兰他敏的收率变化很小。
酶的剂量
PH
时间
温度
液固比
3.3 正交实验的结果
根据表2，通过提取变量A2B3C3D2的结合可得到加兰他敏的最大提取率。在加入4%果胶酶和纤维素酶的混合物，在50℃条件下，用ph4.5的水溶液提取，反应2h，可得到最大提取率[9]。试验的结果表明，反应温度有很大影响，次子的是酶和底物的比例，反应时间，ph值。偏差分析的结果见表3.反应温度的影响有很大不同，同时，酶和底物
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