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为了有效地输送抗癌药物而特制的双重pH敏感聚合物：阿霉素纳米载药系统
金志独，dagger;萧娇独，Dagger;程琼茂，Dagger;王军*，Dagger;
dagger;中科院软物质化学重点实验室和高分子科学与工程系，中国科技大学，合肥，安徽230026，中国
Dagger;CAS的脑功能和脑疾病重点实验室和生命科学学院，中国科技大学，合肥，安徽230027，中国
摘要：有效将治疗药物输到肿瘤细胞并且增加细胞内药物浓度，是癌症治疗中由于耐药治疗和电子细胞有效摄取量不够所产生的一个巨大挑战。在此，我们设计了一个特制的双pH敏感高分子偶联药物的纳米系统来面对这个巨大的挑战。纳米颗粒具有逆转其表面电荷从负到正的肿瘤细胞外pH值（sim;6.8）并且促进细胞内化的强大作用。随后,在亚细胞显著增加酸度隔间等核体内 (5.0sim;)进一步促进阿霉素的释放并形成内源性药物载体。这种双重pH敏感高分子纳米颗粒在对逐渐增强细胞毒性的耐药肿瘤干细胞的控制中显示了其独特的作用,表明了其在癌症治疗领域的巨大潜力。
方案1。双pH释放性聚合物阿霉素（DOX）化学结构的共轭（PPC HYD DOX DA）和pH值的示意图触发细胞间和细胞内药物释放化。共轭自组装成带负电荷的NPs在水（1），和NPS的反应中成为在细胞外pH值的正电荷（2）。积极的纳米粒子进入细胞产生内吞作用（3，4），和DOX后裂解腙键内/溶酶体pH和成核释放（5）.
在过去的十年中，以纳米粒子为基础的药物输送系统由于其改进的有效药代动力学和生物分布的型材通过增强渗透和保留（EPR）等，在癌症治疗已显示出令人欣喜的有效性。然而，EPR 仅能有效提高纳米颗粒在肿瘤组织中的积累（NPS）；很少的细胞内化以及有效的细胞内的药物释放总是限制着抗癌药物的使用剂量和药效发挥，使之总是低于理想的治疗水平，这就在一定程度上阻碍了癌症化疗的疗效。为了应对这些挑战，环境释放输送系统一直试图提高药物的生物利用度，从而提高药物的疗效。这些刺激的反应中，调节pH值是最常用的，在不同组织和细胞器中的pH值变化明显。例如，肿瘤细胞外环境酸性更强（PH6.5），血、正常组织（pH值7.4）、内涵体和溶酶体的pH值保持在5甚至更低的pH（5.0—-5.5）ph值范围内，为此各种运载工具已经开发了用于pH触发药物释放的方法。这些交付体系在某一个pH值条件下的药物释放较好，针对肿瘤细胞外或细胞内的pH值条件下,则会影响药物应有的功效。例如,输送系统对板式换热器经常释放载荷物质并送到那些能够对细胞内环境不能有效地增强细胞内化从而杀死耐药细胞使其效率低下的化境下。双pH敏感纳米粒子的发展，不仅可以促进苯丙氨酸的释放，也能在增强药物输送、增加溶酶体pH值过程中产生巨大作用。这些都还没有形成完整的应用体系被报道出来。
作为一个概念证明，我们在这里描述了双pH敏感高分子阿霉素偶联物（方案1）作为一个药物递送系统。 高分子药物载体可以调节肿瘤细胞外和细胞内pH梯度，通过化学定义机制,同时通过EPR促进药物在肿瘤部位积累效应和促进细胞内化以及细胞内药物释放,可以大大提高药物输送效率。NPs在抗癌药物的疗效评估关键在于药物在耐药肿瘤干细胞内部的释放。在目前的研究中,选择了磷酸，因为它表明生物降解性,被广泛用于生物医学领域，包括药物/基因传递和组织工程等。
PPC - Hyd - DOX -DA共轭是通过多个合成过程（如图S1）和细节描述的支持信息。首先，双亲嵌段共聚物聚（乙二醇单甲醚）-b-聚（丙烯-乙烯磷酸酯）（mpeg - b - paep）是通过开环聚合制备。根据其经过1 h时核磁共振谱(图S2)， PAEP计算的平均程度是75。然后，一个UV诱导的硫醇烯“点击”方法被用于合成半胱胺。图3所示的1H -NMR谱表明，烯丙基基团均经反式转化为氨基。随后，部分氨基转换的反应与2 -亚氨基四氢噻吩巯基组合，这是由埃尔曼实验所证实的。
通过遇到酸不稳定的腙键，将DOX共轭汇聚到到聚合物上，DOX的巯基衍生物（MAL DOX）9与巯基官能化聚合物组合，从而使得DOX结合到PPC - HYD - DOX聚合物上，即为新制备的培养方式。高效液相分析表明，没有未反应的DOX或游离的DOX存在于聚合物溶液中（图S4）。共轭酸处理后释放了完整的阿霉素(图S4),其余氨基酸组与准备的新的PPC - Hyd -DOX聚合物进一步反应，酸酐（甲基丙烯酸甲酯）由于pH敏感分子的作用，其电荷转换成为PPC - HYD - DOX大共轭。在delta;7.80共振时，7.52的核磁共振谱（图5）是DOX的特征共振，而在1.85 ppm被分配到甲基丙烯酸、甲酯残留的甲基基团。A根据紫外-可见光谱在490 nm处的吸光度，计算为8.32 wt%的共轭的DOX的内容，对应于一个共轭电子有效率为76%，与图S5的核磁共振结果一致。由于对DOX残留的疏水性质，动态光散射测量表明，10 PPC - HYD - DOX大共轭自组装成纳米颗粒在水溶液中NPssim;27纳米的直径如图（图6中）。
酰胺键的形成与氨基和甲基丙烯酸甲酯裂解时所处的微酸性条件（如pH在6.8以下）关系密切已经被证明。为了验证本研究的酰胺键酸反应裂解,我们通过反应合成模型聚合物PPC- DA -PPC -DMMA并记录下其1 h内在不同时间点孵化后pH值 (图1)。大约75%的氨基酸组根据积分PPC-DA -Ha比Hb(1:0.35,图1)被转化为羧基组。然而，在pH值为6.8时的孵化过程中，HA HB积分的比例逐渐下降，60分钟达到的值为2.27，对应于60%的羧基回氨基转化，这表明酰胺键的快速酸反应裂解与之相关度非常高。
从而将显示在肿瘤细胞外环境的电荷转换为纳米粒子DOX。如图2A，最初，PPC HYD DOX大颗粒在pH为 6.8和7.4时为负电荷。在pH为6.8时，电位增加显着，在10分钟内，根据HA至Hb的积分比，有效将羧基转化为氨基。尽管NPs在2 h内慢慢实现了电动电势与孵化，pH值为7.4时,它仍负。鉴于细胞膜通常带负电，并且带有电荷转换的行为，PPC-Hyd-DOX-DA NPs在肿瘤细胞外pH敏感分子值会提高细胞内化效率。
由于阿霉素的共轭聚合物酸不稳定的腙键，它应该显示出溶酶体内pH敏感药物的释放。为了证明这一点，我们将纳米颗粒置于不同pH值的培养基实施阿霉素释放并且实施密切监测。如图2b所示，184小时内，pH为7.4时，（DOX的0.33%）被释放的NPs孵育为22.60。在pH值为 6.8时，在同一时期内DOX的累积释放（25.56）的纳米粒子孵育导致略有增加。如图2 b, (184 h时公布的0.33%的阿霉素NPs在孵化pH值7.4时，孵化的NPs pH值为6.8，导致稍微增加累积释放阿霉素，在同期(25.56(0.25%)释放为22.60%。然而，当pH值降低到5，超过75%的DOX 在184 h时从NPS中释放，说明从灵敏度PPC - HYD -DOX - DA内/溶酶体pH从这一点来看，PPC - HYD - DOX和NPS可以降低早产的药物释放过程中的循环，且能够提高细胞内药物释放的效果，这将有利于癌症治疗的有效性的提高。
图3，（a）PPC - HYD - DOX -DA细胞吸收纳米粒子（红色）在pH值为6.8或7.4时，孵化1h后的MDA-MB-231细胞，DAPI（40，6-二脒基-2-苯基吲哚，蓝色）和Alexa fluor488鬼笔环肽（绿色），分别被用来染色细胞核和F-肌动蛋白。（b）PPC - HYD - DOX和NPS的亚细胞分布（红色）在pH值为6.8时，DAPI（蓝色）和Lysotracker Green（绿色）被用来染色细胞核和酸性细胞器。细胞成像使用60水浸泡的目标。
为了进一步证明PPC - HYD – DOX和NPS可以更有效使肿瘤细胞内化的现象，我们比较了PPC - HYD - DOX大纳米粒子的细胞摄取行为在pH为7.4和6.8时的内化现象。我们培养的NPS MDA-MB-231乳腺癌细胞在每个pH值环境下1 h时，其在细胞内的分布的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析评价如图。它在图3A中， DOX和NPS显著内化，在pH 6.8和集中表现在细胞质中，这是很少观察到的细胞在pH值为7.4的相同的NPS孵育。为了避免由于在pH为6.8的腙键裂解释放DOX可能出现的问题，我们进行了一个实验控制共轭PPC - AMI -DOX - DA（图S7），具有相似的结构，除了与阿霉素是有共同的共轭结构通过酰胺键连接。CLSM图像（图8）显示了类似的现象，如图3a，荧光激活细胞分选（FACS）分析（图S9）进一步证实了增强内化的PPC - HYD - DOX大颗粒在pH值为6.8时，带到一起，得出电荷，传统PPC - HYD – DOX和NPS在与苯丙氨酸反应时确实表现出显着增强细胞内化。这是由显著增强细胞荧光显示所表明的。
以下细胞内化，另一个关键的问题是共价结合阿霉素分子可以有效地从NPS释放，由完整的细胞内溶酶体pH来演示这个触发，我们培养MDA-MB-231细胞与PPC - HYD – DOX和NPS在pH 6.8， 2小时的时候，换上新鲜的在pH值为7.4培养基。细胞连续培养并进行CLSM观察。如图3b所示，孵化后PPC -HYD -DOX和NPS在 2 h时主要定位在标记的酸性细胞器，即具有罕见的DOX的细胞核。
图4，固定时间的球体形成球囊细胞孵育后的各种制剂（A和C）和细胞相对数/球在14天测量（B和D）。细胞首先在配方为pH 7.4（A和B）或6.8（C和D）的环境下培育两小时，然后用新鲜的培养基进一步培养，在pH为 7.4时更换。PBS控制设为100%。阿霉素或其等效剂量为2mu;g/kg。然而，从6到24小时，逐渐增加的DOX位于细胞核，使之从DOX到NPS充分释放。
为了进一步证明药物的释放与内/溶酶体pH责任腙链接的年龄有关，我们实施了控制共轭DOX实验，再次使用。随着PPC - AMI - DOX - DA纳米粒子与相同条件下的MDA-MB-231细胞PPC HYD DOX实现孵化，很少观察到细胞核甚至孵化后24h转化为DOX（图10）， 表明DOX不能有效地从细胞反过来，NPS释放后不能直接进入细胞核。不同亚细胞分布的PPC - Hyd - DOX -DA PPC - Am i -DOX -DA NPs显示内 /溶酶体DOX及阿霉素的释放也是不同的。基于这些结果相结合,能够得出 PPC - Hyd - DOX - DA NPs拥有特制的双pH敏感特性。
双pH敏感的纳米颗粒在癌症治疗过程中的优越性在于全面评估癌症干细胞。肿瘤生物学的最新进展已经提出，在实体肿瘤中的微小癌干细胞是负责肿瘤的进展和转移，但他们对化疗高度耐药。即使是一小部分的肿瘤干细胞在化疗和支持肿瘤复发，也能导致治疗失败。但是,有效地杀死癌症干细胞已成为有效的癌症治疗的新策略。16 SK-3rd细胞维持“具备干细胞”悬浮培养的球体,CD44 CD24林具有特色的标志癌症干细胞自我更新能力。球的数量反映了能够在体外自我更新的细胞的数量和细胞/球体的数量测量，以提升每个球体产生细胞的自我更新能力。我们培养的球囊细胞在pH值为7.4或6.8的培养基中，与游离阿霉素一起实现治疗控制。孵育2小时后，药物或纳米颗粒被删除，细胞进一步培养，以允许形成的球体，在第5天、第7天和第14天的球数结果被描绘在图4。在pH值为7.4时，发现三种有药物的配方并没有表现出显着地分球数（图4A）或细胞数/球（图4B）处理。它显示出由于其带负电荷的特性，在pH值7.4时阿霉素被低效交付到SK-3rd PPC - Hyd - DOX -DA球体中。与此相反，在pH为6.8时，球的数量在第5天和7天时细胞获得PPC - HYD - DOX - DA治疗明显减少，这与游离阿霉素和PPC - AMI - DOX - DA治疗相比（图4c，P＜0.005）有明显的差别。
此外，虽然球数明显增高，在14天的PPC - HYD - DOX - DA治疗后，自由阿霉素的治疗和PPC - Ami - DOX -DA相比(p lt; 0.05,图4 d)，球体的细胞数量显著降低， PPC - Hyd -DOX -DA 的敏感属性在板式换热器的作用下,提高了细胞内化,随后释放阿霉素的细胞反应endo /溶酶体pH值,从而抑制癌症干细胞的发展。
总之，这项工作已经证明采用特制的双pH敏感高分子偶联药物纳米粒子是一种有效抗癌药物给药系统。NPS可以适应细胞外和细胞内pH环境，同时提高细胞吸收并促进细胞内酸触发药物释放。在双pH高分子具有敏感性的同时，NPS具有增强抑制耐药癌SK-3rd肿瘤干细胞的进展。到今天为止，一些内/溶酶体pH触发的药物释放NPs已发展为交付系统。最近，一种新的内/溶酶体pH敏感聚合物硼酸酚共轭已被设计为具有增强细胞内药物输送作用的系统。由于这种内/溶酶体的pH响应性可由各种化学结构实现，我们证明了与概念设计相结合的肿瘤细胞外和内/溶酶体的pH响应性疾病提供的一种新的多功能电子在癌症化疗中是一种非常有效的方法。
合成、表征和其他实验细节、相关内容、辅助信息可通过互联网在http://pubs.acs.org免费获取。
“作者信息、通讯作者：jwang699@ustc.edu.cnlt;
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