一种测定石斛属植物中脂肪酸的灵敏的方法--高效液相色谱荧光检测法
Shijuan Zhang1, 2, Cuihua Song3, Guang Chen1, 2, Lian Xia3, Xiaoyan Wang1 and Jinmao You1, 3
摘要
一种新型的高效液相色谱法，使用 2‐(9‐oxoacridin‐10(9H)‐yl)
acetohydrazide (OAAH) 作为脂肪酸检测的预-列标记试剂，首次应用于4种石斛属植物中。OAAH与脂肪酸的反应在1-乙基-3-（二甲基氨基丙基）-碳二亚胺（EDC）作为冷凝剂下可在20分钟内简单快速发生。其衍生物具有良好的激发荧光性能，发射波长分别为255和420 nm。20种脂肪酸衍生物在一个SB C18反相柱中梯度洗脱。所有的脂肪酸具有良好的线性相关性，相关系数gt;0.996。当用50毫克样品分析时，检测范围在信噪比为3下为0.10-0.42 mg/g。游离脂肪酸和4种石斛属植物的所有脂肪酸都用该方法进行分析。其结果表明石斛属中的脂肪酸主要为不饱和亚油酸(C18:2n-6)和饱和脂肪酸。这项工作为石斛属植物的安全评估和质量控制方面提供了一个有用的工具。
实际应用：石斛属植物，其茎可用于医疗目的或作为健康食品，是中国珍贵的植物。近来其显著的医疗效果越来越引人关注。然而，对石斛属植物脂肪酸组成的研究却很少。本文提出了一种灵敏的方法，即用高效液相色谱分析石斛属植物中的游离脂肪酸和反式脂肪酸。这是第一份研究石斛属植物脂肪酸组成的报告。其对石斛属植物进行全面的安全和质量评估有很大帮助。
关键词：石斛属植物； 脂肪酸； 荧光； HPLC
1 引言
石斛属植物，在中国统称石斛，是中国名贵的中药草本植物。石斛最珍贵的品种被称为铁皮石斛，其茎被认为是草本中的黄金，同中国东北种植的人参一样出名。在古代中国，它只有皇室成员可拥有。而现今，它已非常易得，且通常用作健康食品而非药物。紫皮石斛是质量仅次于铁皮石斛的石斛属。它具有同铁皮石斛相似的功能，但比铁皮石斛略微便宜。其他的种类如兜唇石斛则流传更为广泛和便宜。石斛属植物具有治疗白内障，发热，咽喉炎和慢性浅表性胃炎的功能。它们也可以用作促进身体产液和免疫调节的补品[1-3]。石斛属植物的茎传统上常用作医用目的，而铁皮石斛和紫皮石斛则常用于烹饪以提高人的健康状况。为了更好发挥石斛属植物的效用，对其有个全面的了解十分重要。这有许多关于石斛[2,4-7]化学成分的珍贵研究，其中尤以聚糖被频繁地研究。脂肪酸在预防和治疗疾病上发挥了重要作用，如癌症[8,9]，炎症性疾病[10]，视网膜色素变性[11]，精神分裂症[12]，心血管疾病[13],等等[14-16]。一些研究表明，脂肪酸是有效的药用植物[17]的功效成分。但到目前为止，我们没有发现任何关于石斛属植物中脂肪酸成分的研究报告。
脂肪酸不易挥发，也不存在自然紫外线吸收和荧光特性。因此，GC或液相色谱法（LC）结合衍生化是最常用的方法分析他们[18-23]。自20世纪50年代起，GC和GC-MS联用法传统上已用于脂肪酸的分析[24]。例如，长链多不饱和脂肪酸在GC分析中不稳定。此外，常用的衍生化试剂如三氟化硼和重氮甲烷操作很危险。相比之下，脂肪酸的高效液相色谱分析可以在温和的条件下进行。因此，破坏耐热成分的风险也大大降低。因此，高效液相色谱法可以作为代替GC法准确分析脂肪酸的选择。
在这项研究中，发展了一种灵敏的柱前衍生高效液相色谱荧光检测法来分析脂肪酸。具有优良的荧光性能的2‐(9‐oxoacridin‐10(9H)‐yl)acetohydrazide (OAAH)因其易于合成常选择其作为衍生试剂。同时，OAAH和脂肪酸的衍生可在温和条件下于20分钟内进行完全。远少于用其他衍生方法的所需的30分钟[22,23]。提出的这种方法已成功应用于4种石斛属植物中总脂肪酸和游离脂肪酸的分析。据了解，这是第一份研究石斛属植物脂肪酸的报告。
2 材料和方法
2.1 试剂和化学品
所有用作标准的脂肪酸均为色谱级，从西格玛-奥德里奇（美国）购买。1-乙基-3-（二甲基氨基丙基）-碳二亚胺（EDC），乙腈、甲醇、氯仿、正己烷和n-己烷均高效液相色谱级，从西格玛-奥德里奇（美国）购买。纯净的蒸馏水则是从屈臣氏（广州，中国）处购买。所有其他使用试剂为分析级除非另有说明。OAAH则是作者根据王[25]所描述的方法在实验室合成。
2.2 仪器
实行高效液相色谱分析使用了安捷伦1290系列高效液相色谱系统，配备了一个在线脱気器，一个二元泵，一个自动进样器和一个恒温柱隔间。荧光检测器（型号G1321B,安捷伦，美国）调节在波长255和420nm 处激发和发射。色谱分离则在SB C18h柱（2.1 50mm2 ,内径1.8毫米，安捷伦，美国）。溶剂A为5%的乙腈-水溶液，溶剂B为乙腈。流速恒定为0.25毫升/分钟，温度恒定为30℃。流动相梯度条件如下：0-15分钟 40-70%溶剂B，15-28分钟 70-100%溶剂B，然后进行了2分钟。在下一次注射前从最初移动到柱平衡为4分钟。注射量为5毫升。荧光激发和发射光谱数据获得则用F7000荧光分光光度计（日立，东京，日本）。
2.3 样品
四种石斛属植物的干茎从中国杭州的訾布堂药店购买。样品进行分析前先研磨并通过0.25毫米筛。
2.4 OAAH合成
OAAH根据王[25]的描述方法修改后在我们的实验室中合成。常用的吖啶酮和2‐(9‐oxoacridin‐10(9H)‐yl)acetic acid 的合成已被遗弃，而）OAAH的合成减少了4到2的简单步骤。合成路线描绘如图一。
图一 OAAH合成路线及OAAH与脂肪酸衍生过程
2.4.1 ethyl‐2-(9‐oxoacridin‐10(9H)‐yl)acetate 的合成
将2‐(9‐oxoacridin‐10(9H)‐yl)acetic acid（5.0g）和乙醇（150毫升）在250毫升圆底烧瓶中混合并在室温下搅拌10分钟。在10分钟内缓慢加入20毫升浓硫酸。后将混合液加热至80℃并搅拌10小时。再用旋转真空蒸发器除去乙醇。残余物则用200毫升水转移至一个玻璃烧瓶中。用饱和碳酸钠溶液中和至PH=7。后过滤，回收固体沉淀，并用乙醇洗涤3次。所得产品在室温下干燥48小时，可获得黄色晶体。其产率为85.2%。
2.4.2 OAAH
取Ethyl‐2‐(9‐oxoacridin‐10(9H)‐yl) acetate（5.6g），80%苯氧异丙肼水合物（10毫升），乙醇（50毫升）在250毫升圆底烧瓶中混合，并在90℃下剧烈搅拌6小时。冷却后将析出固体过滤回收并用乙醇洗涤。将粗产品用乙腈重结晶，得到浅黄色晶体，在室温下干燥48小时。 产量4.3克（82.0%）m.p.gt;280℃，组成：C 68.02 ；H 5.71； N 14.90 ，计算：C 68.07； H 5.71； N 14.88 ,IR(KBr):3327.12（N-H）;1662.71,1631.01(C=O);1597.65,1607.44(Ph-C=N-);1489.83(C-H);750.51,672.92(Ar-H); MS:m/z [M H] :350.7
2.5溶剂制备
每种脂肪酸用二甲基甲酰胺分别配置母液100mg/L并在阴暗条件下放置4小时。包含所有化合物的标准溶液用乙腈混合稀释。所有所用的化合物的标准浓度的配置应在母液稀释分析当天进行。将3.5毫克OAAH溶解在10毫升乙腈中制备OAAH溶液（1.0*10-3mol/L）。当溶液不在使用，应将其存放在4℃的冰箱中，已提供下次高效液相分析用。
2.6样品的制备
将准备的试样（50毫克）放入5ml的玻璃离心管中称重，再与3毫升石油醚混合。后用超声波进行提取30分钟。样品在4000转/分钟下离心10分钟，后收集上清液并在残余物中加入2毫升石油进行进一步提取。将两次所得上清液混合，取200ml在中速氮气流蒸发至干燥。后对干燥样品中存在的游离脂肪酸进行分析。样品分析所用皂化法按照赵[26]的人的描述进行。将以酯形式存在的脂肪酸转化为分子形式。皂化样品用石油醚萃取，后蒸发至干燥以便后续衍生。
2.7 衍生过程
将含有100毫升的脂肪酸混合标准试样或干样品，100毫升乙腈，100毫升衍生试剂溶液和10毫升（0.02mol/L）EDC加入到一小瓶中。后将瓶子密封并在85℃水浴中反应20分钟。衍生过程如图一所示。反应完成后，将混合物冷却至室温后在1.0毫升衍生后标准试样和样品溶液中加入分别加入690和790毫升乙腈溶液以进行稀释。将稀释后的溶液用0.22毫米尼龙过滤器过滤，后直接注射进行高效液相分析。每一样品重复分析3次。
2.8 衍生参数优化
衍生化参数通过一次仅改变一个参数进行优化。通过分别测定试剂摩尔量从1到10倍，温度从60℃到90℃间的脂肪酸总摩尔量以探究OAAH浓度及温度的影响。EDC与羧酸的摩尔比在0.5-10的研究范围内。提供最高反应速率的参数则在之后的实验中进行选择。
2.9方法验证
分析方法进行了线性度验证，限度检测（LOD）,及准确度和精度。校准曲线由每一化合物的峰面积及浓度（2-200微毫克/毫升）构成。所有提取的样品中的目标化合物均在该浓度范围间进行注射。高浓度的则经过稀释以满足该标准。LOD均在信噪比3的情况下计算。定量分析则采用外标法。通过空白式样与三种不同浓度的标准试样进行回收率计算。回收率计算公式为（测量值-内生值）/增加值*100。日内相对偏差是在5.0ug/g的标准下对一个样品进行6次重复测定得出，日间相对偏差则是在一周内的三个不同时间在同一水平下对一个样品进行三次重复测定。
- 结果与讨论
3.1石斛中脂肪酸的提取
各种方法已被应用到脂肪酸的提取[27-30]。其中索氏提取法被广泛应用但其缺点是时间和溶剂消耗较大。超临界流体萃取非毒性且环保，其缺点是系统较复杂和昂贵，所需样品量大。在许多实验室超声波提取因其简单性很受欢。因此我们该实验应用此方法。而乙醇和石油醚较其他而言提取效率更高。用这两种提取溶剂可观察到脂肪酸的提取回收率高达89%。然后，对于反式脂肪酸的分析，石油醚表现出更好的性能。因此，萃取常选用石油醚。
3.2 衍生条件优化
3.2.1 OAAH-FA衍生物的荧光特性
高效液相色谱荧光检测法重要的是研究衍生物在不同流动相下的荧光性能。脂肪酸的高效液相色谱分析的流动相由水和乙腈组成。因此，OAAH-FA 衍生物通过改变水和乙腈的比例来探究荧光特性变化。如图2所示，溶剂为纯水或纯乙腈都没有明显的红移或蓝移。因此，水和乙腈组成的溶剂比较适合OAAH-FA衍生物的分析。
图二 OAAH-C11 在乙腈和水混合溶剂中的荧光光谱（1-7乙腈和水体积比分别为1:0, 0:1, 4:1, 2:1, 1:4, 1:2, 1:1）
3.2.2 EDC浓度对衍生化的影响
由于其优良的脱水和冷凝性质，EDC成为许多研究中羧酸和肼试剂冷凝最常用的冷凝剂之一[31-33]。据报道，EDC可形成一个易与胺基反应的高度不稳定的活性酸中间体[33]。为使脂肪酸反应完全，EDC量必须充足，但过量的EDC又会带来污染。EDC与羧酸的摩尔比在0.5-10的范围内进行研究。如图三所示，荧光响应随EDC浓度升高而增加。当摩尔比为常数4时，荧光强度达到最大值。需注意的是，EDC对水分十分敏感，因此每次分析前均得重新配置。
图三 EDC浓度和衍生化温度对荧光强度的影响
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- OAAH浓度和反应温度对衍生化的影响
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我们对OAAH浓度对衍生化的影响进行了详细的研究以确保分析物反应的完全进行。结果表明，当摩尔试剂量超过八倍脂肪酸摩尔总量时，荧光强度恒定。进一步增加超过该水平的试剂量，产量无显著影响。为方便操作，取1.0 103 mol/L OAAH进行衍生化。只取50毫克样品用于分析，该浓度对大部分样品来说已足够。反应温度对衍生化的影响也可以进行验证
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