文献翻译——
使⽤⼯程表⾯活性⽣物膜蛋⽩进行简单的蛋⽩质固定
原文作者: Danielle M. Williams,Gilad Kaufman,Hadi Izadi,Abigail E. Gahm, Sarah M. Prophet,Kyle T. Vanderlick, Chinedum O. Osuji,and Lynne Regan
单位: 耶鲁大学物理与工程生物学综合研究生课程，分子生物物理和生物化学系，化学与环境工程,分子、细胞和发育生物学、化学, 纽黑文，康涅狄格州 06511，美国
摘要：酶和其他⽣物分⼦在表⾯上的固定化对于⽣物技术⾄关重要，在⽤于分析或⽣物医学方向的分⼦种类的传感和受控递送⽅⾯具有重要应⽤。以⼀种能够避免变性和⾮特异性相互作⽤的同时又要保持活性位点的可及性的⽅法现蛋⽩质识别元件，是⼀个尚未找到通⽤解决⽅案的挑战。在这里，我们提出了⼀种使⽤⼯程蛋⽩质构建块将任何蛋⽩质固定到表⾯的稳健、简便的⽅法。通过使⽤与同源蛋⽩伴侣（SpyCatcher 和 SnoopCatcher）⾃发反应的肽（SpyTag 和 SnoopTag）功能化界⾯蛋⽩ BslA，我们能够创建显⽰反应性标签的蛋⽩质单层的图案化表⾯。我们证明，这些表⾯可以快速、⾃发地、特别是使附着在 SpyCatcher 或 SnoopCatcher 上的对应的蛋⽩质进行功能化。这种⽅法既能保护表⾯免受⾮特异性吸附，⼜能以均匀、活性的构象呈现识别元素。我们觉得这种⽅法将具有⼴泛的应⽤，包括⽤于诊断应⽤，治疗相关蛋⽩质的固定化。
关键词：:蛋⽩质⼯程, ⾃组装, 疏⽔蛋⽩, 模块化, 界⾯蛋⽩, 蛋⽩质固定化
【简介】
将⽣物分⼦固定在固体⽀持物上在⽣物技术和⽣物医学中有许多应⽤，包括核酸（或蛋⽩质）微阵列和⼤量类似 ELISA 的⽣物传感器。表⾯固定有利于暴露分析物、洗涤和检测等的步骤过程。将蛋⽩质特定位点排列到表⾯上的能力，有利于对分析物进行⾼通量检测。典型的⽣物传感器需要固定识别元素，这通常是指蛋⽩质。要实现蛋⽩质识别元素⼀致呈现⼀个表⾯，同时避免该蛋⽩质与该表⾯的我们不希望的位点和潜在的变性位点相互作⽤，这仍然是⼀个未解决的问题。在表⾯上实现天然蛋⽩质的⼀致呈现，增加该蛋⽩质对分析物的可及性并最⼤量给定区域中的天然蛋⽩质，这两者都增加了分析物检测的灵敏度。通常情况下，只要识别元件表面的⾮特异性、⾮共价键，例如微量滴定板的聚苯⼄烯， 就⾜以满⾜实验室应⽤。然⽽，在许多情况下，需要尽可能⾼的检测灵敏度和特异性，并且需要⼀种便捷的在给定表⾯积中始终如⼀地呈现最⼤量的功能的识别元素的⽅法。人们已经采取了⼏种不同的方法来解决这个重要的问题，但尚未建⽴直接⼴泛且适⽤的策略。
已采取的另⼀种⽅法是⽤⽣物亲和试剂涂覆表⾯法。例如，将涂有亲和素或链霉亲和素的表⾯结合⽣物素化的分⼦，或将涂有 Ni-NTA 的表⾯结合六组氨酸标签蛋⽩。这两种方法都涉及非共价识别元件与功能化表面的相互作用。NTA ⽅法的功效受到六组氨酸标签与Ni2 -NTA 的结合亲和力低的阻碍，Ni2 -NTA通常⽆法通过必要的多次洗涤步骤。此外，对于某些蛋⽩质，⾦属依赖性的或者⾮特异性的蛋⽩质容易被吸附到表⾯也是⼀个问题。虽然链霉亲和素（或亲和素）与⽣物素的相互作⽤也是⾮共价的，但它具有极⾼的亲和力。使⽤链霉亲和素的主要问题是每个链霉亲和素分⼦都有四个潜在的⽣物素结合位点，这可能导致固定与呈现出现异质性。
图 1. 蛋⽩质构建块的卡通和丝带表⽰。 (a) BslA 结构的丝带（来⾃ PDB 4BHU，左）和卡通表⽰（右）。橙⾊表⽰疏⽔ N 端区域，蓝⾊表⽰亲⽔ C 端 区域。 (b) BslA 和荧光融合蛋⽩的卡通表⽰。 SpyTag（蓝绿⾊三⻆形）和 SnoopTag（紫⾊三⻆形）连接到 BslA（橙⾊和蓝⾊椭圆形）的 C 端。 SpyCatcher（栗⾊皇冠）和 SnoopCatcher（⾦⾊皇冠）分别连接到 eGFP（绿⾊星暴）和 mCherry（红⾊星暴）的 C 末端。 (c) 丝带（来⾃ PDB 4MLI）和 SpyCatcher 蛋⽩（栗⾊冠）和 SpyTag（蓝绿⾊三⻆形）的卡通表⽰。显⽰了在 SpyCatcher 上的 Lys 和 SpyTag 上的 Asp 的侧链之间形 成共价键。 (d) SnoopCatcher（⾦冠）和 SnoopTag（紫⾊三⻆形）的卡通表⽰。显⽰了在SnoopCatcher 上的 Asn 和 SnoopTag 上的 Lys 侧链之间形成共价键。
共价相互作⽤提供了⼀种更稳定的连接⽅法。⼀种常⻅的共价连接⽅法是使⽤“点击”化学，该术语包含许多反应，其中⼀些反应利⽤了炔烃化学。共价键是“⽆痕的”，但许多连接的过程需要很⻓的反应时间，可能⻓达数天。因此，我们提出了⼀种简单、具体且可扩展的⽅法，可以将感兴趣的蛋⽩质共价固定在表面上。该⽅法成功利⽤了天然蛋⽩质独特的物理和化学特性：BslA（图1a），它在疏⽔/亲⽔界⾯⾃组装形成单层，和⼯程链球菌表⾯蛋⽩⾃发形成共价两种不同多肽上的Lys和Asp/Asn 侧链之间的异肽键。两个不同的蛋⽩质对 SpyCatcher和SpyTag以及SnoopCatcher和SnoopTag （图1c，d）的可行性，它们不会发⽣交叉反应，为同时显⽰不同的蛋⽩质识别元素提供了⼀条途径。该⽅法的主要特点是所有组分均重组表达并⾃发反应，且效率⾼。我们预计，如本实验所⽰，多个识别元素的多路复⽤、空间上的不同显⽰将有助于单样本多分析物检测。点击反应是快速的、特异性的，并且在⽔性条件下也反应良好。然⽽，它们通常需要将⾮天然氨基酸（例如有含叠氮基侧链的氨基酸）掺⼊要固定的蛋⽩质中，以与表⾯上的炔烃反应，而实现⾮天然氨基酸的⾼效掺⼊仍然是⼀个需要积极研究的领域。化学连接的另⼀种⽅法是在表⾯涂上以 N-羟基琥珀酰亚胺酯为末端的分⼦，它可以与氨基酸的伯胺基团反应，赖氨酸残基在蛋⽩质表⾯形成酰胺键。这种⽅法的⼀个明显限制是酯⽔解在⽔溶液中的竞争反应，会导致蛋⽩质附着的产量相对较低。此外，赖氨酸残基在蛋⽩质表⾯上很丰富，因此结合很少是位点特异性结合，因此产⽣的表⾯具有显着的构象异质性。天然肽连接 (NPL) 和许多与蛋⽩质剪接相关的固定技术已作为 NPL 的衍⽣物开发，其中⼀种值得注意的⽅法是表达蛋⽩质连接 (EPL)。这些⽅法是有利的，因为它们能使 BslA (16 kDa) 与 SpyTag (13-残基肽) 和 SnoopTag (12-残基肽) 和荧光蛋⽩与 SpyCatcher (12 kDa) 和 SnoopCatcher (13 kDa) 融合，我们创建了一种⽅法，反应性蛋⽩质对（图1b）。该⽅法的主要特点是能使所有组分均重组表达并⾃发反应，而且效率⾼。我们预计，如本实验所⽰，多个识别元素的多路复⽤、空间上不同的显⽰将有助于单样本多分析物检测。
图 2. BslA 结构的表⾯压力-⾯积等温线。使⽤LB仪器获得数据。对于每种蛋⽩质，在三个独⽴实验中测量了表⾯压力与⾯积等温线。单个实验的数据以⿊⾊（圆形、正⽅形和菱形）显⽰，三个测量值的平均值以彩⾊三⻆形显⽰（100% wt BslA，橙⾊；25% BslA-SpyTag/75% wt BslA，蓝绿⾊；25% BslA-SnoopTag/75% wt BslA，紫⾊）。不同的蛋⽩质单层都表现出相似的塌陷压力，约为65 mN/m。我们计算了23 mN/m 时每个分⼦的平均⾯积，这对应于在施加机械压缩力之前可达到的最⼤表⾯压力，对于wt BslA (a)为 656 Aring;2 ， 对于 25% BslA-SpyTag/75% wt 为753 Aring;2 BslA (b)，25% BslA-Snooptag/ 75% wt BslA (c) 为 679 Aring;2 。与同⼀单层的不同测量值相关的变异性被计算为每次试验的标准偏差，并且都是最⼩值（约plusmn;1%）。更多的可变性与蛋⽩质浓度的测定有关（约plusmn;20%）。
图 3. 载玻⽚⽤ FOTS 图案化、⽤ BslA 蛋⽩沉积和⽤荧光蛋⽩探测的不同过程⽰意图。图案不按⽐例绘制。 (a) PDMS 微柱印章（带有柱⼦的深灰⾊装置）与 FOTS 溶液（橙⾊）⼀起培养，然后⽤组织吸⾛，产⽣“着墨”印章。将印章放在⼀个⼲净的载玻⽚（深灰⾊的⼩矩形）的顶部，上⾯有20克的重物。去除砝码和印章，留下印有圆形疏⽔ FOTS 斑点的六边形图案的载玻⽚。(b)注⼊25%BslA-SpyTag/75% wt BslA 或 25% BslA-SnoopTag/75% wt BslA（橙⾊和蓝⾊椭圆形）并使其平衡到 LB 槽的空⽓-⽔界⾯（浅灰⾊仪器）。平衡后，屏障被压缩到 23 mN/m 的表⾯压力，在空⽓-⽔界⾯形成蛋⽩质单层。使⽤ LS 装置（LB 槽上⽅的浅灰⾊矩形）降低从 (a) 制备的图案化载玻⽚以与蛋⽩质单层接触。与单层接触后，将25% BslA－SpyTag/75% wt BslA 或 25% BslA－SnoopTag/75% wt BslA 的疏⽔末端转移到疏⽔点处的载玻⽚上，从⽽形成图案化的载玻⽚显⽰蛋⽩质单层。将载玻⽚储存在去离⼦⽔中直到进⼀步使⽤。(c) 显⽰在 b 部分中制备的蛋⽩质单层的图案化载玻⽚与 20-50 mu;M GFP-SpyCatcher 或 mCherry-SnoopCatcher（中图）的溶液⼀起培养。未与 BslA-SpyTag 或 BslA-SnoopTag 蛋⽩结合的多余荧光蛋⽩⽤ DI ⽔冲⾛，得到带有荧光标记圆形斑点的载玻⽚（右图）。冲洗后，⽤纸⼱吸⼲载玻⽚并使⽤荧光显微镜成像。
图 4. 荧光显微镜图像和定量分析。所有⽐例尺均为 50 mu;m。 (a) 印有 FOTS 图案的载玻⽚的荧光显微镜图像，显⽰25%BslA-SpyTag/75%wt BslA （左）、25% BslA-SnoopTag/75% wt BslA（中）或100%的单层wt BslA（右）与 GFP-SpyCatcher ⼀起培养。图像被错误地着⾊以将 eGFP显⽰为绿⾊。 (b) 四个点的荧光强度分布，来⾃ a 部分的图像：带有 100% wt BslA（橙⾊圆圈）、25% BslA-SpyTag/75% wt BslA（蓝绿⾊三⻆形） 和 25% BslA-SnoopTag 图案的幻灯⽚/75% wt BslA（紫⾊⽅块）⽤ eGFP-SpyCatcher 探测。 (c) 印有 FOTS 图案的载玻⽚的荧光显微镜图像，显⽰为单层 25% BslA-SpyTag/75% wt BslA（左）、25% BslA-SnoopTag/75% wt BslA（中）或 100% wt BslA（右）与 mCherry-SnoopCatcher ⼀起培养。图像被错误地着⾊以将 mCherry 荧光显⽰为红⾊。 (d) 四个点上的荧光强度分布，来⾃ c 部分的图像：带有 100% wt BslA（橙⾊圆圈）、 25% BslA-SpyTag/75% wt BslA（蓝绿⾊三⻆形）和 25% BslA-SnoopTag 图案的幻灯⽚/75% wt BslA（紫⾊⽅块）⽤ mCherry－SnoopCatcher 探测。
【结果与讨论】
野⽣型（wt）BslA在空⽓-⽔界⾯⾃组装形成坚固的单分⼦层，其性能良好特征。对于这种现象的研究，我们使⽤了 Langmuir-Blodgett (LB) 装置来形成⼀致的、包装良好的 BslA 单层。我们之前的实验表明，将 13 个残基肽 SpyTag 添加到 BslA 的C末端不会明显⼲扰 BslA 单层的形成。在这个功能化研究中，我们使⽤了25% BslA-SpyTag/75%% wt BslA 的混合物和 25% BslA-SnoopTag/75% wt BslA的混合物。我们选择了标记和 wt BslA 的混合物，⽽不是使⽤ 100% BslA-SpyTag 和 100% BslA-SnoopTag，以减少通过 BslA的C端肽连接到单层的分⼦之间的空间⼲扰。我们通过使⽤ LB 装置测量表⾯压力-⾯积等温线来表征这种单层的行为（图2）。可⽐较的坍塌压力和平均分⼦⾯积清楚地表明，这些混合单层的行为与 100% wt BslA 的行为⾮常相似，表明与 SpyTag 和 SnoopTag 肽的C端融合对单层⼏乎没有⼲扰。
使⽤ Langmuir-Schaefer (LS) 适配器将基于 BslA 的蛋⽩质单层从空⽓-⽔界⾯转移到疏⽔/⽔表⾯。我们⾸先使⽤微接触印刷在玻璃表⾯上创建具有独特疏⽔点图案的载玻⽚（图3a）。疏⽔点是通过使⽤聚（⼆甲基硅氧烷）（PDMS）印章对悬浮在⼄醇中的三氯（1H、 1H、2H、2H-全氟⾟基）硅烷（FOTS）进行微接触印刷⽽产⽣的。载玻⽚表⾯的其余部分未经处理。使⽤ LB 装置形成蛋⽩质单层并压缩⾄ 23 mN/m 的表⾯压力。该值是根据先前的研究选择的，该研究表明，它可以形成可靠地没有明显变形的单层。然后使⽤ LS 附件将单层转移到带图案的载玻⽚上（图3b）。
在初步实验中，我们测试了疏⽔表⾯上单层 wt BslA 防⽌荧光蛋⽩⾮特异性吸附到玻璃上的能力。在没有 BslA 涂层的情况下，荧光蛋⽩融合物很容易⾮特异性吸附到疏⽔表⾯（图S2)。相⽐之下，当表⾯带有单层 BslA 时，这种⾮特异性结合会被有效地消除。这从疏⽔点区域的荧光相对于与载玻⽚的⾮特异性结合的荧光减少中可以看出（图 S2)。这些数据值得注意，因为它们表明，除了提供⼀种将我们需要的蛋⽩质附着到表⾯的新⽅法外，BslA 涂层还可以消除感兴趣的蛋⽩质与该表⾯的⾮特异性结合。在感知的背景下，这有望减少假阴性，即让⼈们可以更自信地判断我们需要的的物质是不存
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