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通过傅里叶变换红外光谱法测定牛奶中的丙酮从而实现对亚临床酮病的检测
C. Heuer,* H. J. Luinge,dagger; E.T.G. Lutz,dagger;,Dagger; Y. H. Schukken,sect; J. H. van der Maas,dagger; H. Wilmink, and J.P.T.M. Noordhuizen*
摘要
傅里叶变换红外光谱法（FTIR）常常结合偏最小二乘回归法（PLS）使用以测定牛奶中丙酮的浓度。傅里叶变换红外光谱法（FTIR）光谱与顶空气相色谱法的结果进行对比，整个光谱的主要成分(3000 to 1000 cm1)分析表明，丙酮的分析光谱减少1450至1200cm1。一个二阶导数应用于光谱去除基线效果和进一步加强光谱特性。全交叉验证用于与不包括模型开发的样品丙酮浓度基准进行比较参考。偏最小二乘回归法（PLS）应用于全光谱范围内会产生一个具有0.22mm的交叉验证误差的19因子综合模型。减少光谱和取二次导数之后，我们获得了一个带有7个能产生0.21mm交叉验证误差的因子的模型。这要优于之前报道的带有20因子和0.25mm误差的模型。使用偏最小二乘回归法（PLS）预测检测奶牛亚临床酮病，当亚临床酮病阈值为0.4至1.0mm，会导致95至100%的敏感性和96至100%特异性。这相应的阳性预测值76%，阴性预测值98%，整个亚临床酮病的患病率的假定范围为10至30％。
（关键词：牛奶丙酮，红外光谱，亚临床酮病，乳牛）
介绍
最大能量摄入和利用早期哺乳期是高产奶牛保持最佳的健康和生产的关键(Goff and Horst, 1997)。产后不充足的能量摄取会增加患初级酮症的风险(Lean et al., 1991)，并可能导致增加初次排卵和不受孕的时间(Senatore et al., 1996)。能量和其他营养物质的真实摄取往往是偏离计划配给的(Simensen et al., 1990)，因为DMI不仅取决于配给，而且还取决于不断变化的环境因素，如气候，粗饲料质量，动物密度，饲养条件，或喂食方法。因此检测高产奶牛群的营养摄入对营养的管理非常重要。
能量摄入和能量需求之间的区别在于能量的平衡，能量平衡的可行指标是在血液或牛奶的BCS和葡萄糖，游离脂肪酸，酮体的浓度(Dirksen et al., 1997; Gravert et al., 1986; Magdus et al., 1988)。牛奶中酮体的假定预测能量来自于饲料，牛奶中的丙酮与牛奶生产和繁殖性能呈负相关。(Anderson and Emanuelson, 1985; Gustafsson and Emanuelson, 1996)。
牛奶的傅里叶变换红外分析法已被建议作为一种方法来确定牛奶中的葡萄糖，BHBA，和丙酮的浓度(Luinge et al., 1996)。本次试点实验的初步结果是有前景的，但样品是不足以建立一个精确的数学模型。近日，在丹麦成功地进行了实验通过红外光谱确定了牛奶中的丙酮 (Hansen, 1999)。
预计牛奶丙酮将是最有可能被用来辨别患亚临床酮症奶牛。在群体层面，生酮奶牛的比例可以提供一个负能量平衡度的有用指标，因此提供一个方法来判断当前的饲料质量。因而我们比较了不同基准值和阈值的FTIR预测的丙酮，从而显示出FTIR模型预测在奶牛筛选中的实用性。
这项研究是我们以前的实验的后续工作和意图评估汉森（1999）的调查结果。这目的是要开发一种已知的准确度和精度用于测定丙酮的FTIR预测模型，并通过FTIR预测评估奶牛亚临床酮病。
材料和方法
奶牛和采样
14只奶牛在Utrecht University的兽医学院的临床场所被用于了实验研究。所有奶牛都于1999年1月至3月在临床场所产犊。该实验旨在研究在两种喂养制度下牛奶脂肪或正常身体状况的反应差异，即等于或低于能量需求的。14只奶牛中的7只在最后2周干奶期间喂养约上述要求的20%，并根据产犊的需求的喂养直到2周后进入哺乳期。产犊时，这7只奶牛相比于供给达到要求的其他7只奶牛有0.5至1.5甚至更高的BCS。之后，这两组都被喂以低于要求的能量以减少能量平衡并最终患上酮血症。
在这个试验中，牛奶样品在哺乳期的第1周到15周，每周收集一次或两次（星期一及星期四）。为了确保混合均匀，我们在整个挤奶过程倒一部分牛奶到一个单独的试管里。无防腐剂添加到样品中，将其取样后进行2至6小时的红外线测量。在这段时间内，将样品保持在室温(18 to 20C)。拆分样品保存在酸钠中，用快递寄到实验室，并通过以下描述的检测方法检测牛奶丙酮。所有样品试管都至少装了其容量的80%，并用螺旋盖盖紧，避免丙酮的蒸发。用以下描述的检测方法检测总的219份样品，因为实验室的误差导致12份被排除（低容量，两份样品之间的巨大差异）。在其余的207份样品中，每天有两份（共27份）样品没通过FTIR测试，因为它们已经在室温里储存了超过6小时。剩下的180份样品开始进行最后的分析测试。
两个样品组可以建立一个预测模型来测定牛奶中的丙酮。第一组的116份天然牛奶样品来自奶牛哺乳期的第1周到第11周。第二组的64份牛奶样品来自哺乳期的第7周到第15周，这些样品通过掺入丙酮，以获得除了天然丙酮含量之外目标浓度为0.0，0.8，1.2，1.6，和2.0mm的样品。
参考方法
这拆分的牛奶样品保存在叠氮化钠中广泛用于乳制品行业的日常牛奶测试方案。实际丙酮浓度通过顶空和毛细管气相色谱法配合火焰离子化检测器作为一种参考方法来进行确定(GC-17A, Shimadzu, Japan)。该方法已被描述在别处 (Vitenberg and Reznik, 1984)。测量由 Qualitatsprufungs- und Dienstleistungsgesellschaft (MQD) Mecklenburg-Vorpommern mbH进行。
简而言之，丙酮读数是比较甲乙酮组成的内部标准和标准化的丙酮浓度梯度得出的。来自全脂奶粉（12.5%重量）的复原乳常被用于制备储备溶液。每100ml丙酮原液I含有99.4mg丙酮和104.9mg甲基乙基酮，每100ml零原液I含有104.9mg甲基乙基酮，每100ml丙酮原液II含有14.59g丙酮原液I，每100ml零原液II含有14.59g零原液I。丙酮储存溶液的合并，导致0，10，25，50，75，和125mg丙酮/ L的标准丙酮浓度各含150mg甲基乙基酮/L。后者也被加入到试验样品中，以便4ml（密度1.020g/cm3）的最终体积中包含0.050ml的内标。样品和对照品溶液在顶空样本分配器中温育(HSS 30.01, IDC Langewiesen, Germany) ，在将它们转移到气象色谱之前最少在80C 的环境下温育60分钟（100C 阀温度，0.1分钟转移时间）。样品和标准液一式两份一起进行测试。该方法的可重复性为0.06mm丙酮（3.7mg/L）与3.4％的变异系数。
傅里叶变换红外光谱法
单光束红外光谱以8cm1的分辨率记录在一个Per- kin-Elmer Spectrum Quant 2000FTIR光谱仪 (Oosterhout, The Netherlands)的4000至900cm1之间，场均32次扫描。在测量之前，将样品搅拌并加热15分钟至44C，转移到仪器中并使用一个两步均质器在17和8.5 kPa的压力下将其变均匀。样品在温度控制（40C），厚度为34 micro;m CaF2传输单元中测量。软化水，类似地处理，被用来作为背景。光谱减少的波数范围为3000至1000cm1。以上的样品，产生吸水性增强（O-H伸展）。而CaF2的吸收性可以阻止低于1000cm1波数的使用。另外，因为强大的吸水性使得1700至1580cm1之间的区域被去除。图一展示就是一个牛奶频谱的例子。
图一：牛奶和水背景的傅里叶变换红外光谱测量的示例。奶脂（fat），乳
蛋白（prot），和牛奶中的乳糖（lact）的典型吸收被显示，强吸水性的范围被排除在外。主要丙酮峰在1239到1370cm1之间。丙酮的相关范围为1200到1450cm1。
显然，可见的是在2926，2855，和1747cm1的特征吸收峰，对应于脂肪酸残基的不对称和对称的CH2伸展和C=O伸展振动。这 1552cm1的波段是蛋白质的Amide-II波段，而围绕1076cm1波段的强烈吸收性是由乳糖引起的。
模型开发
由参考方法测得的牛奶中丙酮的结果进行了详细的评价。因为样品是从同一批牛中反复采集（180份样本，14头奶牛），丙酮有牛内相关可能性。这种内牛相关性可能会导致人为估计的小偏差，并因此导致较大的预测误差。为了测定牛内相关的程度，我们要通过方差分析天然样品和掺入样品的牛内相关系数(rho;) (McDermott and Schukken, 1994; Snedecor and Cochran, 1984）。
样品光谱的变化是通过全光谱分析主成分(PCA)和减少到一定数量几乎包含数据中存在的所有信息的变量来进行评估的。原则上主成分分析各波数权重是根据相应的光吸收当前整个总量而产生数量的变化而确定的。具有高变化的波数相比于低变化的波数获得更高的权重。按照惯例，每个波数处的权重被称为负荷，并且可以在一个载荷谱绘制。载荷谱指出数据的主要光谱变化和装配到每个光谱中的数据集，它的贡献被表示为一个分数。载荷谱是整个数据集的属性，分数为每个光谱描述光谱之间的差异。 除去分数的产物和来自每个光谱的载荷谱（也称为因子）之后，该过程可以被重复以找到其它因素。为了防止随后计算的分数中的任何相关性，采取特别的预防措施，以使后续载荷谱相互正交 (Draper and Smith, 1981)。最终的结果是有限组的k载荷谱和每份样品对应的k分数的每组载荷谱。数是基于在数据变化的，并不一定就有关于丙酮的变化，偏最小二乘回归法（PLS）常被用于模型开发。PLS确保载荷和分数通过浓度信息数据还原步骤反映不同的丙酮浓度相关的方差(Martens and Naes, 1989)
模型验证
许多因素的最优值k用于分析预测得到的一组独立的样本对于不同的k值和确定的值预测均方根误差是最小或不显著不同。这个误差被称为标准预测误差定义为。
SEP =
其中，yr是一个丙酮浓度基准的示例，yp为测的丙酮浓度，n是验证样品的数量。这种误差也被称为均方根预测误差，并已被描述，并作为总偏差的标准偏差的量度 (Bibby and Toutenburg, 1977; Hansen, 1998, 1999)。预测的标准误差是通过交叉验证将一份样品从校准组中除去而估算得到的，一个模型是其余样品使用PLS开发的，并且最初留下的样品是被预测的。这个过程对于在校准组每个单独样品都是重复进行的。均方根预测误差这样获得被称为交叉验证（SECV）的标准误差。PCA和PLS是使用Perkin Elmerrsquo;s Spectrum Quantsoftware package进行的。
筛选亚临床酮症
预测牛奶丙酮的分类为“阳”或“阴”不一定是完全一样的参考值。正确分类的比例由灵敏度和特异性说明。灵敏度是正的参考值的比例，是PLS模型的正面的正确预测。特异性是负基准值的正确分类的比例。灵敏度和特异性在不同的阈值下可能是不同的。一个好的预测可能会导致在一定范围的相关阈值相同的灵敏度和特异性，在0.4至1.4mm范围的丙酮的情况下。
在实际使用中，兴趣不仅在于个别奶牛真阴性或真阳性丙酮浓度的精确复制。一个更重要的问题是阳性或阴性的测试结果是否可靠，这与正值的频率而变化，因此
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