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ATR‑FTIR光谱非破坏性地检测由损伤引起的
番茄果实腐烂感染
Paul Skolik1 · Martin R. McAinsh1 · Francis L. Martin2
摘要
主要结论：ATR-FTIR光谱技术及其后的多变量分析可通过光谱的变化，直接或间接地无损地识别疾病进展过程中的植物-病原体相互作用。
植物-环境相互作用对于理解作物生物学、优化作物使用和尽量减少损失以确保粮食安全至关重要。因此，番茄 (Solanum Lycopersicum)等脆弱水果作物的损伤致病菌感染是与作物生物学和现代园艺相关的重要过程。果实表皮作为植物-环境界面的第一屏障，特别参与环境相互作用，往往在不利条件下表现出实质性的结构和功能变化。然而，用于研究这类系统的方法以其固有的形式存在，受到经常需要的和破坏性的样品制备或少量的分子水平信息的限制。探讨樱桃番茄损伤性病原感染的生化变化及诊断潜力。直接和间接地应用了中红外光谱(MI R)，并结合探索性多元分析。红外光谱（1800-900厘米）minus;1用主成分分析和线性判别分析(PCA-LDA)对健康、受损或酸腐病感染的番茄果实进行了提取和鉴别。 对健康番茄果实表皮的主要生化成分进行了表征，多元分析区分了健康番茄与受损、早期或晚期酸腐感染番茄的细微生化变化，间接地基于果实表皮的变化。直接在体内检测引起的酸腐病，并根据不同于番茄果实的光谱特征进行表征。利用线性判别分类器(PCA-LDC)评价了基于番茄果皮间接病原检测的诊断潜力。对ATR-FTIR光谱的探索性和诊断分析为完整的植物-病原体系统提供了生物学见解和检测潜力，因为它们在园艺工业中被发现。
关键词
MIR光谱学；植物-病原相互作用；多元分析；作物生物学；念珠地丝菌
引言
为快速增长的全球人口提供营养，其中大部分人营养不良，这是现代时代面临的最大挑战之一（IFPRI 2017）。由于其对环境的影响和长期的不可持续性，传统的解决方案，例如增加土地开垦和增加使用农药来生产足够的食物，都是不利的。因此，需要新的替代方法来有效地生产到2050年所需的粮食约增加70％（Beuchelt and Virchow 2012）。在整个食品生产/供应过程中，害虫和病原体的损失对农作物构成了重大威胁。害虫和病原体可能使农作物减产80％，从而对农作物的生产力提出了重大挑战（Oerke 2006）。因此，在收获前和收获后的环境中检测有害生物和病原体对于将对作物生产的影响降至最低至关重要。收获后的消费者阶段可以看作是粮食生产/供应过程中最关键的阶段之一，因为在这一阶段已经实现了最大的资源分配，这使得植物与病原体的相互作用在这一阶段尤为重要。当前用于农作物健康诊断的方法包括遥感，基于分子的方法和复杂的分析技术，所有这些都有缺点。遥感（包括高光谱成像和热成像）对环境条件和与被测物体的距离具有高度响应性，很难确定疾病的特异性（Mahlein 2016）。基于分子的技术[例如，聚合酶链反应（PCR），荧光原位杂交（FISH）和酶联免疫吸附测定（ELISA）]非常耗时且容易受到污染（Chitarra和Van Den Bulk 2003； Schaad和Frederick 2002；Wall ner等人，1993）。复杂的分析方法，例如气相色谱或液相色谱与质谱联用（GC / LC-MS），需要大量的样品前处理，很难在油田中使用（Martinelli et al.2015）。
能够提供足够的检测灵敏度和病原体特异性的柔性，非破坏性传感器的开发是检测农作物病原体的关键目标（Mahlein 2016; Skolik et al.2018）。这包括检测植物胁迫或病害的早期效应，区分非生物和生物胁迫效应以及不同疾病之间的能力以及量化胁迫或病害的严重程度的能力（Mahlein 2016）。虽然正在开发各种分子和成像技术来检测农作物病原体，但许多分析方法的局限性以及上述传感器技术标准的结合，导致了无标记，无损光谱技术的发展，该技术可提供有关化学物质的信息被分析样品的结构。源自分析化学的光谱方法已主要通过计算分析的进步和测量活样品的能力而转化为生物科学（Chan和Kazarian，2016年）。这些技术在植物和农作物系统模型中的应用有可能为植物与病原体的相互作用提供新颖的见解，同时产生大量变量以自动分类疾病状态以检测有害生物和病原体。
中红外（MIR）光谱作为一种无损，快速的生物分析传感器技术，在生物科学领域取得了长足的进步（Martin等，2010）。这是因为MIR光谱在提供分子洞察生物系统方面是有效的，同时提供了许多变量来区分样品。最近，光谱化学技术在植物和作物科学领域取得了长足的进步，特别是在分析与作物生产相关的动态过程和植物生物学方面（Butler等人，2015年，2017年；Ord等人，2016年；Skolik等人，2018年）。这主要是通过开发包括多元分析在内的新数据分析方法而有效的。对于MIR生物光谱学，数据分析可以分为两种主要类型：探索性和诊断性。探索性分析主要针对数据可视化和模式识别（Trevisan等人，2012）。诊断分析利用classifer算法来评估诊断样本状况（例如健康还是疾病）的潜力（Trevisan等人，2012年）。虽然这两个框架通常具有不同的目标，但是它们是紧密联系的，并且通常，在诊断框架之前进行探索。在许多可用的数据分析选项中，无监督的主成分分析（PCA）和监督的线性判别分析（LDA）已被单独使用或结合使用来成功地基于MIR数据研究大量的生物学现象（Li等，2015; Strong等人，2017年）。PCA和LDA均已成为生物光谱数据分析的核心组成部分。相关分类器包括支持向量机（SVM）和线性判别分类器（LDC）也已在诊断框架中得到了广泛的应用。这些进步突显了MIR生物光谱学作为植物和作物科学的有效传感器技术的潜力（Skolik et al.2018）。尽管取得了这一进展，但对完整样品的研究数量却是有限的，这无疑是开发完全无损园艺传感器的重要先决条件，因此需要对完整样品进行更多的研究。近年来，衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）和拉曼光谱法都被用于研究重要农作物的完整样品（Butler等人2015; Ord等人2016; Fu等人2016; Trebolazabala等人，2013年）。拉曼光谱法是FTIR光谱法的一种补充方法，通常将两者结合在一起以进行更可靠的分析，因为它们各自具有独特的缺点，因为它们测量的是不同的光-质相互作用（Baker等，2014； Butler等，2016）。与微距FTIR相比，作为低概率事件的拉曼散射可能变化很大，容易受到荧光干扰，测量面积通常在20至30 micro;m之间，并且使用的激光功率更大，有可能导致光致漂白（组织分解）精细有机样品的提取（Butler等人2016; Yeturu等人2016）。尽管如此，先前的研究已经证明了拉曼光谱的有效性（Egging等人2018; Farber and Kurouski 2018; Yeturu等人2016）。虽然直接检测植物与病原体的相互作用会产生适合疾病检测的光谱变化，但是由于病原体的侵袭，通过组织中光谱变化的间接检测植物感染仍然很困难，但是提供了一种新颖的方法。
本文中，我们使用ATR-FTIR光谱研究了在商业上获得的，消费阶段（红熟）完整樱桃番茄中直接或间接地引起的腐烂病原菌G. Candidum对损害和周围环境的影响。常规光谱分析用于表征番茄和真菌假丝酵母的主要吸收峰，然后进行探索性和诊断性多变量分析，以探究由损伤和感染间接引起的细微生化变化。 使用PCA–LDA的串联技术，对番茄果实表面的变化进行了表征，以应对伤害和酸腐感染，从而最大程度地提高番茄果实受损，感染和对照之间的类间差异。使用串联分类器PCA-LDC评估该方法的诊断潜力，以间接和自主地将受损和感染的番茄果实与健康对照区分开。
材料和方法
样品的准备和储存
Piccolo是从当地超级市场（Sainsburyrsquo;s Lancaster Main Store, UK）获得番茄的。所有分析均在公告的到期日之前进行，该到期日在购买时为8天。番茄从最初的葡萄包装中取出，并在室温（23plusmn;1°C）和相对湿度35–40％的条件下适应2小时，然后再进行初步分析。将散落的西红柿分成两组，包括一个对照系列，该系列说明了在分析时间内自然成熟的西红柿发生的变化（图1a–c），以及在0 h时刺穿茎疤的一组西红柿，直至用21号无菌注射器针头大约1厘米的深度，剩下的皮肤完好无损（图1d）。因此，受损的西红柿很容易在穿刺部位受到环境感染，这在穿刺后48小时开始可见，并且在穿刺后96 h观察到穿刺的茎疤完全定植（图1f）。将对照番茄和受损番茄在相同条件下黑暗保存在纸板箱中，以比较病原体的发育并允许茎疤痕感染周围的真菌孢子。随后在与货架寿命匹配的对照相反的位置分析受损的番茄果实（0小时），让它们在穿刺后48和96 h自然老化，以评估由初始损害引起的病原体感染。在分析之前，用去离子水彻底清洗番茄果实，以去除灰尘和碎屑，以及在感染初期（48 h）和感染后期（96 h）阶段存在果实上的真菌生长和液体渗出物，在进行光谱采集之前，为了表征果皮的变化，而没有真菌本身（单独分析）的贡献或感染部位的渗出物。穿刺后96 h，完全定殖的番茄上的趣味半乳糖复合物（图1f）得到了番茄果实天然状态下真菌的光谱图。
图1 与番茄果实损伤(d)、早期(e)和晚期(f)感染番茄果实有关的症状与其保质期匹配的对照组(a-c)相比
ATR-红外光谱
使用带有Diamond ATR Helios附件的Bruker Tensor 27红外光谱仪（英国考文垂的布鲁克光学公司），从完整的番茄果实中获取MIR光谱。在4000-400 cm-1范围内获得光谱，光谱分辨率为8 cm-1，数据间隔为3.84 cm-1，具有32种共掺和镜速为2.2 kHz，以获得最佳信噪比（Martin等人2010; Baker等人2014）。在每个样品之前采集背景光谱以说明周围的大气条件。钻石ATR定义的空间分辨率（采样区域）约为250 micro;mtimes;250 micro;m。将整个水果放在样品台上，施加压力不超过0.1 kg。在样品测量之间，使用含异丙醇的ATR清洁抹布（英国考文垂的布鲁克光学公司）在两次测量之间清洁ATR金刚石晶体。从水果圆周上测量了五个点。从五个点中的每个点获得两个光谱，每个水果总共进行10次测量。每个水果10个光谱通常可以为PCA–LDA提供足够的重复，从而提供了类内差异（即，对0 h对照vs0 h损害，48 h对照vs48 h早期感染和96 h对照的变异性）与96小时的后期感染相比），同时最大程度地减少了自然组织异质性的影响，从而潜在地掩盖了植物对病原体反应的微妙影响。每个治疗组测量六种水果。在感染后期（穿刺后96小时），对番茄念珠菌进行了体内测量，未作任何修饰，作为番茄病原体复合物的一部分。在测量过程中，真菌团块完全覆盖了ATR晶体。测量六个假丝酵母样品（每个真菌样品有10个光谱）以获得有代表性的体内光谱。
预处理和计算分析
所有计算分析均使用专门用于红外光谱分析的开源IRootlab工具箱（https://github.com/trevisanj/iroot Lab）（Trevisan et al.2013）结合Matlab 2016（The Math Works，MA进行，美国），除非另有说明。将原始光谱截断到1800到900 cm-1之间的光谱指纹区域，这是生物分子吸收IR辐射的主要区域。使用类似橡皮筋的基线校正算法对指纹图谱进行预处理，并对其进行最大值归一化，以解决样品厚度和ATR金刚石接触压力方面的差异。类平均光谱用于直接分析。探索性PCA可将数据集减少到考虑光谱差异的因素；使用IRootlab pareto函数对PCA进行了优化，其中前10台PC占数据集中方差的99％以上[请参见支持信息（SI）图S1]。这些作为形成复合技术PCA-LDA的LDA的输入变量（Tre Visan等人，2012）。虽然PCA降低了光谱数据的复杂性，但它是不受监督的，不考虑类别标签，将所有类别视为一个类别，因此出于提取类别特定差异的目的（Tre，不区分对照，损坏或感染的番茄 Visan等，2012）。结合有监督的方法，遵循PCA的LDA（PCA–LDA）可以最大程度地区分类别之间的光谱差异（对照与损害/感染），从而可以提取与损害和随后的酸腐相关的特定类别生物标记（ Martin等，2010；Kelly等，2011；Trevisan等，2012）。两类之间的成对比较会生成一个线性判别式（LD），该线性判别式总结了对照组和有病番茄果实之间主要类别的CIFC差异。该线性判别式可以可视化为聚类图，其中每个光谱定义为一个点，其中点的重叠和分离分别表示相似或不相似的特征（Trevisan等人，2012）。 PCA–LDA加载提供了一个“频谱图”图，该图表明了波峰数，在该波峰处，类别之间的差异最为明显，如峰值大小（方差）所示。峰值最大值用作指示正在研究的生物过程的“光谱生物标记”（Kelly等，2011）。
探索了通过沿LD1进行簇分离的探索性分析，以确定对照组和受损/感染组之间的显着变化是否明显。在每种情况下，均按0、48和96 h对受损，早期和晚期感染的番茄及其保质期匹配的对照进行成对比较。为了表征主要频谱变化，将PCA–LDA载荷与识别峰值最大值的峰拾取算法（最小间隔20 cm-1）
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