农田土壤反硝化甲烷厌氧氧化细菌的多样性研究外文翻译资料

 2022-12-04 15:08:45

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毕业论文

英文翻译

原文标题 Presence of diverse Candidatus Methylomirabilis

oxyfera-like bacteria of NC10 phylum in agricultural soils

译文标题 农田土壤反硝化甲烷厌氧氧化细菌的多样性研究

农田土壤反硝化甲烷厌氧氧化细菌的多样性研究

L.-d. Shen1, H.-s. Wu1, Z.-q. Gao2,3, J. Li1and X. Liu1

1 Collaborative Innovation Center on Forecast and Evaluation of Meteorological Disasters, Jiangsu Key Laboratory of Agricultural Meteorology,

College of Applied Meteorology, Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing, China

2 State Key Laboratory of Atmospheric Boundary Layer Physics and Atmospheric Chemistry, Institute of Atmospheric Physics, Chinese Academy

of Science, Beijing, China

3 College of Geophysics and Remote Sensing, Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing, China

关键词：

Candidatus Methylomirabilis oxyfera、分布、多样性、Illumina 16S rRNA基因测序、NC10细菌、定量PCR

通讯信息：

沈李东，南京信息工程大学，应用气象学院，江苏省农业气象重点实验室，气象灾害预测与评估协同创新中心。中国，南京，210044。

E-mail：shenld@nuist.edu.cn

doi:10.1111/jam.13119

收稿日期：2015年10月22日；修订日期：2016年1月2日；接收日期：2016年2月23日

摘要：

目标：更好的探究隶属于NC10门的反硝化甲烷厌氧氧化（DAMO, denitrifying anaerobic methane oxidation）细菌在土壤环境中的分布和多样性。

方法和结果：采用Illumina高通量测序和定量PCR（qPCR）技术对不同深度的农田土壤中DAMO细菌进行群落分布和多样性的研究。实验发现，在每个样品中，DAMO细菌的相关基因序列可占16S rRNA基因总序列数的0.8-4.5％。所研究的不同深度土壤中，深层土壤中DAMO细菌16S rRNA基因的比例比表层和亚表层更高。所获得DAMO细菌序列与Candidatus Methylomirabilis oxyfera 16S rRNA基因序列的相似度为85.1–96.9%。农田土壤中存在多样性的DAMO细菌：在所试土壤中一共检测到了115个操作分类单元 （OTUs, operational taxonomic unit）（以3%序列差异作为OTU分类标准）。系统发育分析表明，在所试样品中存在4组明显差异的DAMO细菌（Group A、Group B、Group C、Group D)，其中Group B为优势种群。Group A的DAMO细菌（DAMO反应的优势功能微生物）多存在于50-60 cm的土层中。qPCR结果进一步证明，土壤中存在DAMO细菌，数量为3.8*106-9.3*106 拷贝 g-1土壤。

结论：结果表明，通过Illumina 16S rRNA基因测序和qPCR技术，证明了农田土壤中存在高多样性的DAMO细菌。

对今后研究的意义和影响：本文报道的DAMO细菌多样性是迄今报道最高的，这使我们对该菌群落结构的分布特点和多样性有更深一步的理解。

1 引言

甲烷是一种重要的温室气体，它对温室效应的作用是等摩尔二氧化碳的作用的20-30倍（IPCC 2014)。微生物参与下的、氧气为电子受体的甲烷好氧氧化反应和硫酸盐型甲烷厌氧氧化反应（AMO; anaerobic methane oxidation）被认为是环境中两种重要的甲烷汇 (Knittel and Boetius 2009; He et al. 2012)。近期，有报道表明，反硝化甲烷厌氧氧化（denitrifying anaerobic methane oxidation; DAMO）在淡水湿地 (Hu et al. 2014)和湖泊 (Deutzmann and Schink 2011; Deutzmann et al. 2014)中的甲烷氧化过程中有着不可忽视的作用。然而目前对该过程在减少甲烷排放中的重要性程度仍然缺少明确的认知 (Shen et al. 2015a)。DAMO首次在实验室富集培养中被证实 (Ettwig et al. 2008, 2009)。该反应由DAMO细菌lsquo;Candidatus Methylomirabilis oxyfera (M. oxyfera) 催化进行(Ettwig et al. 2010)，该细菌隶属于尚未研究的NC10细菌门 (Rappe and Giovannoni 2003)。由16S rRNA基因系统发育分析表明，NC10细菌可分为4组，Group A、Group B、Group C、Group D (Ettwig et al. 2009)。在当前的研究中，Group A细菌被证实在DAMO反应中起占主导地位 (Ettwig et al. 2009; Luesken et al. 2011a; Ding et al. 2014)。然而，其他几组类型的DAMO细菌在反应中的作用和地位仍然不能明确。随着现代分子生物技术的发展，尤其是针对DAMO细菌16S rRNA基因和甲烷氧化功能基因（pmoA）的特异性引物的报道，DAMO细菌被证实在不同类型生境中存在，包括湖泊沉积物(Deutz-mann and Schink 2011; Kojima et al. 2012; Deutzmann et al. 2014)，河流沉积物 (Shen et al. 2014a; Zhu et al. 2015)，河口沉积物(Shen et al. 2014b; Chen et al.2015)，海洋沉积物(Chen et al. 2014; He et al.2015)，稻田土壤(Shen et al. 2014c; Zhou et al. 2014; Zhu et al. 2015)和淡水湿地土壤(Hu et al. 2014; Shen et al. 2015b,c; Zhu et al. 2015)。但是，由于在先前研究中采取方法的局限性(比如说针对DAMO细菌特异性引物存在一定的偏向性; Ettwig et al. 2009)，环境中的DAMO细菌群落的分布和多样性很可能被极大地低估以及认识不足。最初，16S rRNA基因的特异性引物（qp1f-qp2r and cmo182-cmo568）或者pmoA的引物均主要基于M. Oxyfera富集培养物和少量的环境样品设计的(Ettwig et al. 2009; Luesken et al. 2011b)。实验表明，仅有特定种类的DAMO细菌在环境中能够匹配特异性的引物。与使用特异引物的基因文库相比，应用低偏向性通用引物的Illumina的16S rRNA基因测序，有助于更好的检测环境中的DAMO细菌。

如今基于Illumina平台的16S rRNA基因高通量测序被广泛的应用于土壤微生物群落结构和生态多样性的研究(Wang et al. 2012a; Ligi et al. 2014; Ma et al. 2015)。此外，这种现代分子生物学技术手段，也常常应用于识别环境中的特定的基因序列（例如，厌氧氨氧化细菌）(Wang et al. 2014; Shen et al. 2016 a,b)。为了更好的研究土壤环境中DAMO细菌的群落结构和生物多样性，本论文将联合基于Illumina平台的16S rRNA基因高通量测序手段和定量PCR技术（qPCR），对不同深度土壤样品DNA进行分析。

2 材料和方法

2.1 采样点概况和土壤样品采集

采用柱状采样器于2015年3月在江苏南京农田土壤采集土壤样本，采集深度为0-100 cm，共采集5份。所采集的样本，以10 cm深度间隔进行分割，然后将同一深度的土壤样本混合在一起，组成新的混合土壤样本。针对4个代表性深度，包括土壤表层（0-10 cm），亚表层（20-30 cm）和两个深层（50-60 cm和90-100 cm），进行土壤中DAMO细菌群落结构、多样性、数量的研究。所采取的土壤置于无菌容器中，在三小时内运送至实验室。在进行理化分析之前，将一部分土壤样本置于4 ℃冰箱中保存，另一部分土壤样本置于-20 ℃冰箱中储存，用于后续的分子生物学分析。

2.2 化学分析

土壤样本与水混合之后（土/水=1:2.5）测定其pH。通过重铬酸钾氧化法测定土壤有机质含量（Bao 2000）。使用2 mol/L的KCL溶液提取土壤中的氨盐、亚硝酸盐、硝酸盐（Shen et al. 2013），并如先前所描述的方法测定各含量（Dorich and Nelson 1984; Kempers and Zweers 1986）。通过烘干法测定土壤水分含量（置于105 ℃）。

2.3 DNA抽提

用Power Soil DNA Kit（Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA）对土壤样品所有细菌基因组进行DNA抽提，按照操作说明进行。DNA的抽提质量使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测评估，DNA浓度用NanoDrop光度仪（ND-1000; Isogen Life Science, the Netherlands）测定。

2.4 Illumina 16S rRNA测序

使用2*300 bp双末端MiSeq测序平台测定细菌16S rRNA的基因序列。简明地说，根据先前已报道的方法，细菌16S rRNA的基因（V3-V4区域）通过319f引物（5rsquo;-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3rsquo;）和806r引物（5rsquo;-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3rsquo;）扩增 (Fadrosh et al. 2014; Shen et al. 2016a)。PCR产物通过琼脂凝胶纯化试剂盒进行纯化 (Qiagen, Chatsworth, CA)，然后进行Illumina MiSeq测序 (Hangzhou Guhe Information and Technology Co., Ltd., Zhejiang, China)。通过微生物生态学定量分析的方法对获得的序列进行分析(QIIME, www.qiime.org)（

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