饮用水中硝酸盐污染：人类遗传毒性风险评估外文翻译资料

 2022-08-08 20:17:41

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饮用水中硝酸盐污染：人类遗传毒性风险评估

Jos C.S.Kleinjans,HarmaJ.Albering,AnitaMarx,JanM.S.vanMaanen,BenvanAgen

摘要：由于硝酸盐衍生的亚硝酸盐会致癌性N-硝基化合物的脂肪酸马汀，饮用水中的硝酸盐污染会带来更大的风险。到目前为止，流行病学研究已经提出了关于硝酸盐水平与胃癌发生率之间关系的研究结果。鉴于不断增加定期饮用饮用水中的硝酸盐水平，这种不确定性具有相关性。在尝试应用遗传生物标志物分析来改善有关硝酸硝酸盐死亡的风险评估的基础上，该研究评估了暴露于低、中、高饮用水硝酸盐水平的人群的外周淋巴细胞染色体损伤，而后者仅在私密水井之前发生。我们发现饮用水中的硝酸盐会导致女性志愿者体内24-硝酸盐硝酸盐排泄所监测的硝酸盐负荷量的剂量依赖性增加，但这似乎与外周淋巴细胞姐妹染色单体交换频率无关。

关键词：硝酸盐污染，饮用水水质，地下水水质

  1. 介绍

具有潜在毒性的化学化合物进入公共供水系统可能对人体健康构成直接威胁。在大多数欧洲国家中，过去十年来，河流和地下水中的硝酸盐含量逐渐增加，这主要是由于农业大量使用肥料和化肥，从而威胁到饮用水水质。世界卫生组织（WHO）和欧洲经济共同体（EEC）关于饮用水水质的指南指出：最高允许的硝酸盐浓度分别为44.3和50.0mg硝酸盐/升，国际上的未来情况预测，高浓度时将超过2000年的发病率。世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会已根据许多实验动物以及人体对硝酸盐衍生的亚硝酸盐诱导高铁血红蛋白血症的研究中的无影响水平，将硝酸盐的每日可接受摄入量设定为5mg/kg；体重3-5公斤的奶瓶喂养的婴儿被认为是发生的高危人群。

内源性亚硝酸盐衍生的亚硝酸盐导致形成致癌的N-亚硝基化合物，可能引起第二种健康风险，其可能与硝酸盐的摄入增加有关。食入性硝酸盐在胃肠道吸收和再循环后，口腔中的细菌活动会导致其还原成亚硝酸盐，随后可能在胃中由食物中也存在的重新摄取的亚硝酸盐和仲胺合成致癌的N-亚硝基化合物。然而，流行病学研究提供了相互矛盾的证据来支持这一假说：已经报道了逆向的，或不存在关联和正相关性，后者表明硝酸盐饮用水中20至30mg/g时的胃癌风险增加。世界卫生组织得出结论，没有提供确定的流行病学证据将胃癌的增加与饮用水中高硝酸盐水平联系起来。但是，据称可用数据不足。鉴于饮用水供应中硝酸盐污染水平的不断提高，有关环境硝酸盐负荷与致癌风险之间关系的争论可能再次变得相关，特别是因为在硝酸盐浓度为50mg/L的情况下，饮用水性硝酸盐的消耗量大大有助于硝酸盐总体摄入量提高。

在荷兰的林堡省，由于施肥造成的地下水硝酸盐污染（主要来自动物粪便），使饮用水水质受到威胁。为了防止EEC硝酸盐浓度超过50mg/L，已经需要使用不含硝酸盐的水进行稀释。在一项试点研究中，我们将林堡地区11个城镇的胃癌死亡率与饮用水中的硝酸盐水平相关联，从而也使用了食道和膀胱癌发病率的数据，因为致癌的N-亚硝基化合物显示出明显的趋有机作用，涉及除胃之外的其他各种靶标。未发现显著关联，部分原因是不可避免的统计能力不足。鉴于建议将经过验证的生物标记物应用于环境卫生现场研究以应对癌症流行病学的这些方法的局限性，我们随后考虑了关于通过饮用水摄入硝酸盐致癌危险的生物学效应参数的评估。因此，本研究的目的是评估硝酸盐消耗与遗传毒性事件之间的关系，该事件指示生活在饮用水硝酸盐污染水平不同的地区的人的癌症风险。

  1. 实验材料和方法

我们确定了三个测试人群，其饮用水摄入硝酸盐风险日益增加。来自两个经常饮用饮用水的城市的家庭主妇代表“低”风险组暴露于0.13mg硝酸盐/L饮用水中，而“中等”风险组暴露于硝酸盐水平为32.0mg/L，并知情同意，自愿参加。参加者没有疾病，没有职业暴露，没有使用药物，没有怀孕，并且通过选择住在相同类型的政府补贴房屋中的家庭来实现社会经济地位的标准化。此外，他们的年龄，吸烟行为（平均吸烟年龄分别为13.2plusmn;4.7和14.9plusmn;3.4岁）相匹配（低风险组的平均年龄为33plusmn;5岁，中等风险的亚组的平均年龄为33plusmn;4岁）。以及居住时间（14.7plusmn;12.1对18.1plusmn;12.1年）。受试者同意回答有关食物消耗和生活方式习惯的调查问卷，并捐赠唾液，24小时尿液和静脉血样本。由于亚组人群通过饮用水摄入硝酸盐的风险较高，因此接触了使用私人水井供水的女性受试者。这些水至少在过去两年中经过我们实验室的验证，其硝酸盐含量范围为56.0至311.0mg/L（平均133.5plusmn;68.5 mg / L）。中低风险的两个测试组均由30个人组成。由于高度污染的私人饮用水井的发生率有限，高危人群仅限于18名女性，她们更倾向于年龄较大（平均40plusmn;8岁），因此无法单独与低暴露人群相对应。采样发生在1989年5月，6月和8月的9:00至12:00之间。要求受试者在样品采集前不要进食。急性处理后，按推荐的方法处理5 mL唾液样品和24尿液排泄物并保存。在肝素化试管中收集五毫升静脉血样品。将所有样品尽快（通常在1-2小时内）运送到实验室。

问卷调查了已知会混淆姐妹染色发生率（SCE）频率的生活方式因素，以及食物消耗的频率和数量，分为三类：饮酒以及非酒精饮料，尤其要注意咖啡，茶，啤酒，牛奶和自来水；通常已知含有相当高浓度的亚硝酸盐和硝酸盐的马铃薯，水果和蔬菜的摄入量；以及面包，三明治，奶酪和三明治肉的食用，也因其亚硝酸盐和硝酸盐含量高而闻名。从这些食物查询数据中分别计算出硝酸盐的口服摄入量，再分别结合市政饮用水或私人水井中测定的硝酸盐浓度，以及各种国家研究机构在荷兰食品中分析的硝酸盐食物含量（国家公共卫生与环境保护研究所，比尔托芬；TNO-CIVOT毒理学和营养研究所；等等）。为了分析唾液中的亚硝酸盐，将5mL唾液样品收集到试管中，该试管中装有0.5mL在氮气下干燥的NaOH作为防腐剂，运输到实验室后在4摄氏度下保存。分析之前，将0.1mL的ZnSO4添加到2 mL的唾液中，用冰代替15分钟。随后将混合物以3000转离心10分钟。亚硝酸盐含量通过标准比色法（ISO方法编号2918）确定。

在分析唾液中硝酸盐含量之前，将1至2mL的ZnSO4加入2mL唾液中，并将混合物置于冰上15分钟。以12000转离心5分钟后，将上清液通过22克Millex GM过滤器（Millipore）过滤。使用Kratos Spectroflow-400泵，设置在214nm处的Kratos Spectroflow 980可编程UV检测器，ChrompackMicrosphere C18色谱柱（100 x 3.0mm ID）和装有Microsphere C18的预柱通过HPLC测定硝酸盐浓度。流动相由PicA试剂（0.005M磷酸四甲基铵水溶液）组成。流速为1.0mL/min。

为了测定尿中硝酸盐的浓度，将7.5g NaOH添加到24小时尿液样本中，然后将其存储在4°C下。分析之前，立即将ZnSO4添加到10mL尿液中，并将混合物在冰上静置15分钟，然后在3000转下离心10分钟。使用Boehringer应用硝酸还原酶，通过分光光度法采集50毫升样品用于硝酸盐分析。由于其他化合物的干扰，似乎无法通过HPLC测定尿中的硝酸盐水平或通过光谱照相法测定唾液中的硝酸盐浓度。通过将硝酸尿液浓度乘以每天排泄的尿液量来计算二十四小时的硝酸盐排泄量。通过应用SC Eassay来确定静脉穿刺取样的染色体损伤外周血淋巴细胞的染色体损伤，从而评估这三个测试人群的遗传风险，该方法已被证明是可靠的人类遗传毒理学检测工具。先前已经描述了用于SCE频率评估的方法。本质上，将0.4mL的死血与5mL富含10％胎牛血清并含有125U/mL青霉素，125g/mL链霉素，5mML-谷氨酰胺和50U/mL肝素的RPMI 1640培养基一起培养72 h 37C，并添加植物血凝素（PHA）为了刺激细胞生长。在PHA孵育24小时后，以58，M的终浓度将5-Bromodeoxy-uridine（BrdU）添加到淋巴细胞培养物中。培养72小时后，通过用秋水仙胶（0.2mu;g/ mL）处理2小时来收获中期。通过低渗KCI处理诱导细胞裂解后，制备淋巴细胞SCE载玻片并通过33258 Hoechst-plus Giemsa技术染色。每人开始两次淋巴细胞培养，并进行每细胞培养，分析至少10个中期（每个个体20个中期），最少40个染色体。将SCE的数目在46条染色体上归一化，并将其平均为每个个体每个细胞的SCE数目。幻灯片由两名独立的观察员进行编码和盲目分析。

通过单向方差分析对几组之间通过饮料水和食物摄入硝酸盐，以及硝酸亚硝酸盐排泄的差异进行统计评估。通过学生t检验对未配对值进行分析，分析了两个亚组之间差异的统计学显着性。应用线性和多元回归分析来评估各种效果参数之间关联的可信赖性。可能性分析用于研究特定人群亚单位中SCE发生率与总体人群相比升高的风险。SCE频率与各种硝酸盐暴露水平和吸烟行为之间的关系已通过方差的双向分析（不平衡设计）进行了评估。

  1. 结果

图1示出了总硝酸盐负荷暴露群，其是根据饮用水（图1A）和粪便（图1B）的摄入量与24-尿素硝酸盐排泄（图1C）相关的硝酸盐剂量计算的。单因素方差分析表明，在不同的硝酸盐暴露水平下，各组之间从饮用水摄入量计算得出的硝酸盐剂量之间存在显着差异（p=0.0001）。从食物消费中计算得出的硝酸盐剂量在这三个人群之间没有差异（p=0.394）。分别消耗低、中和高硝酸盐浓度的饮用水的人群中硝酸盐的平均唾液浓度似乎分别为6.01plusmn;2.41g/ mL，5.41plusmn;1.14，g/mL和23.39plusmn;8.18g/mL。随着硝酸盐摄入量增加的风险（ANOVA显着性水平atp= 0.009），二十四小时尿中硝酸盐的排泄量相应增加，因此似乎可以可靠地反映每天通过饮用水的硝酸盐消耗量。这已通过对受试者总数（n=78）进行回归分析而得到证实，而对吸烟者和不吸烟者之间没有区别，因为这表明个体24尿液硝酸盐排泄物（图2）以及个体唾液中硝酸盐浓度（数据未显示）显着（尿液），r= 0.23，p lt;0.05；唾液，r = 0.25，p lt;0.05）与根据报告的饮用水摄入量计算出的硝酸盐剂量相关。

在这项研究中，暴露于低、中和高硝酸盐浓度饮用水中的人的亚硝酸盐平均唾液水平分别为7.65plusmn;7.70 ug / mL，5.49plusmn;5.10zg/mL和11.65plusmn;7.67pg/mL。但是，唾液中的亚硝酸盐浓度不能可靠地监测口服硝酸盐的摄入量，因为多次回归分析显示，个体间差异较大时，唾液中的亚硝酸盐含量与硝酸盐和亚硝酸盐的消耗量有关。

因此得出的结论是，在硝酸盐摄入量增加的情况下，测定硝酸盐的24小时尿排泄量可作为监测全身硝酸盐负荷的标志。进一步得出结论，饮用水中的硝酸盐污染导致人体硝酸盐负荷的剂量依赖性增加，这是通过唾液硝酸盐浓度和24-尿硝酸盐排泄来衡量的。

表1显示了来自饮用水中低、中和高硝酸盐水平的受试者的外周淋巴细胞的平均SCE频率。结果表明，增加人体硝酸盐负荷不会影响总人群中淋巴细胞的SCE频率。在硝酸盐暴露与吸烟行为之间发生了关于外周淋巴细胞SCE频率的统计学上显着的相互作用。比值分析还显示，饮用水中硝酸盐水平相对较高的人群亚单位，其外周血淋巴细胞SCE发生的风险没有增加。表1还表明吸烟引起外周淋巴细胞染色体损伤：在研究人群中，硝酸盐摄入量增加的中度和高风险与非吸烟者相比，吸烟个体的SCE频率显着升高。此外，Students t检验分析显示，有历史吸烟习惯的非吸烟者的淋巴细胞SCE频率比无吸烟史的受试者更高：非历史性非吸烟者的平均SCE频率为7.3SCE/细胞（n=33）与7.2SCE有吸烟史（n=17）的非吸烟受试者的单元。通过奇数分析证实了这一点。

图3显示了与24小时尿硝酸盐排泄有关的个体SCE频率，并且显示出负相关的统计学上无统计学意义的趋势。多元回归分析评估了尿液硝酸盐排泄，吸烟（每天抽烟的香烟数量，香烟年数），年龄和口服避孕药对外周血淋巴细胞SCE频率的可能影响，表明仅每日抽烟的数量与淋巴细胞显着相关（beta;=0.14）频率。因此可以得出结论，由饮用水中硝酸盐污染引起的人体硝酸盐负荷增加，并不代表无毒性风险，如通过外周血淋巴细胞SCE频率监测的那样。

  1. 讨论

文献中报道的有关人体硝酸盐负荷的数据往往变化很大。报告的唾液浓度范围为7-62sg/mL，而24-硝酸硝酸盐排泄的水平大约为50-90mg/天。此外，在一般环境下评估人体硝酸盐负荷与硝酸盐暴露之间的关系得出了矛盾的结果。本研究报告了唾液浓度和硝酸盐的24小时尿排泄物非常适合在此范围内，但进一步显示，根据饮用水摄入量计算出的人体硝酸盐水平与口服剂量之间存在明显的关系，这可能表明硝酸盐动力学具有内源性稳态。

在这些硝酸盐摄入量的水平上，应该期望由硝酸盐衍生的亚硝酸盐形成致癌的N-亚硝基化合物。在印度，已观察到内源性亚硝化在相当高的口服硝酸盐剂量（gt;260mg/天）下急剧增加，但也显示出正常的饮食硝酸盐摄入量。本研究中来自食物调查的数据表明，在处于低、中和高硝酸盐消费风险的被调查人群中，分别有30％，33％和61％的人超过了此硝酸盐阈剂量260mg/天。但是，鉴于存在1dw硝酸盐暴露风险的受试者报告平均每日硝酸盐消费量为209.7plusmn;89.5mg/天，这大大高于先前公布的饮食中硝酸盐总摄入量的数据，含硝酸盐食物消费的过度报道可能是可能的。尽管存在这种可能的偏见，但仍可以假设这些受试者中确实发生内源性亚硝化，因为最近已证明饮用硝酸盐水平约为50mg/L或更高的饮用水与内源性产生的N-亚硝基化合物的暴露增加有关。在这方面，应该注意的是，遗传毒性风险的评估通常不能仅基于外周血淋巴细胞SCE频率的确定，但如推荐的那样，应进行其他细胞遗传学终点参数的分析，例如HGPRT基因座点突变或微核的形成。

鉴于先前的流行病学结果显示估计的硝酸盐消耗量与胃癌死亡率之间呈负相关，因此本研究中观察到的24小时尿液硝酸盐排泄与外

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