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 2022-08-19 15:40:11

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通过添加还原的石墨烯氧化物厌氧氨氧化的快速启动工艺

摘要

在这项研究中，建立了两个流式塔反应器，以研究还原氧化石墨烯（RGO）对厌氧氨氧化工艺启动的影响。连续实验表明，添加RGO的厌氧氨氧化工艺的启动时间可以从67天缩短到49天。进一步的研究证明，添加RGO的厌氧氨氧化反应器即使在高氮负荷率（NLR）的影响下也具有相对较高的厌氧氨氧化细菌活性和更强的稳定性。培养220天后，R2（添加RGO）的氮去除率达到1.08 *103 g-N/(m3 d)，比R1（对照组）的0.846 *103 g-N/(m3 d) 高27.4％。加入RGO后，脱氢酶（HDH）活性急剧增加，这可能是厌氧菌快速启动的引发因素。与对照组相比，通过定量PCR和荧光原位杂交分析，在整个操作过程中，R2中的厌氧细菌数量增加。

关键词 ： 厌氧氨氧化 快速启动 还原石墨 厌氧氨氧化菌活性

  1. 引言

自从1990年代初期在反硝化流化床反应器中发现厌氧铵氧化（厌氧氨）以来，厌氧氨相关的技术得到了飞速发展，并成为最近一个用于处理高铵浓度和低COD含量的有前途的生物工艺。与传统的硝化-脱氮工艺相比，厌氧氨氧化工艺具有显着的优势，例如不需要氧气和有机碳，低污泥产生以及减少的CO2或N2O排放。因此，厌氧氨氧化工艺被认为是一种可持续发展的生物脱氮技术。

尽管已经进行了许多关于实验室规模甚至全规模厌氧氨氧化过程的研究，但是由于其相对较慢的生长速度和成倍的时间（从11到20天不等），因此快速启动厌氧氨氧化细菌仍然面临挑战。第一个厌氧氨氧化反应器的启动花费了将近3.5年的时间。这表明急需为厌氧氨氧化工艺寻求更快的启动策略。 在过去的几年中，缩短启动时间的努力通常要选择合适的反应堆类型。尝试使用不同类型的污泥，并使用不同类型的载体。它们都有自己的缺点和优点。 此外，增强厌氧氨氧化细菌的活性并进一步加速细胞生长可能是缩短厌氧氨氧化过程启动时间的另一种方法。

石墨烯氧化物（GOs）是在其基面和边缘带有环氧化物，羧基和羟基的分层和氧化的石墨片，在微生物学中引起了广泛的关注。这些材料具有一些非凡的特性，例如大表面积，出色的胶体性质和低细胞毒性。更重要的是发现还原氧化石墨烯（RGO）的电子转移能力比GO高约三个数量级。证明涂在过滤器上的RGO可以诱导大肠杆菌更快的生长。 同样，以前的研究表明，通过使用含氨的生物质可以将RGO从GO中还原。报道称，尽管未解释促进机制，但添加75 mg / L RGO可以使厌氧氨氧化生物质的总氮（TN）去除率增加10.2％。加入RGO可以测试厌氧氨氧化生物量中TN去除率提高17.2％，酶活性提高1.5-2倍。 因此，有理由推测，通过添加RGO连续培养，可以提高厌氧菌的细胞数量，从而使厌氧氨氧化过程迅速启动。 迄今为止，尚未进行关于从添加RGO的活性污泥中启动厌氧氨氧化工艺的研究。

因此，本研究的主要目的是：（1）验证通过添加适当的RGO（剂量为100 mg / L）开发快速启动厌氧氨氧化反应器的可能性（2）评估RGO对RGO的影响。 整个操作过程中大量的厌氧菌和酶活动。

图1.的厌氧氨氧化反应器示意图。

2 材料和方法

2.1.微生物和饲料培养基

将污水处理厂的活性污泥接种在两个流式塔式反应器中。接种后的污泥在两个反应器中的最终混合液挥发性悬浮固体（MLVSS）浓度约为4960 mg / L。厌氧菌营养培养基包括（NH4）2SO4，NaNO2，KHCO3（500 mg / L），KH2PO4（27 mg / L），MgSO4times;2H2O（300 mg / L）和CaCl2times;2H2O（180 mg / L）。

2.2. 连续实验

两个相同的流动固定床塔式反应器，R1（控制反应器，不加RGO）和R2（加RGO 100 mg / L）用于连续实验。 工作容积约为0.3 L，内径为5 cm，15厘米的高度。 两个反应堆的重量为30克（湿重）种子活性污泥导致MLVSS的初始浓度为每个反应器4960 mg / L。 与R1不同，将30 mg GO与种子污泥均匀混合，然后添加到反应器R2中。 先前的研究确定了100 mg / L的最佳剂量。在反应堆启动时，影响NH4 -N和NO2-N剂量分别为50 mg / L和65 mg / L。 初始水力停留时间（HRT）为6 h，对应于氮气负荷率（NLR）为460 g-N /（m3 d）。 两个反应器都连续注入相同的介质，并用99.5％的N2吹扫注入液，以保持溶解氧（DO）低于0.5 mg / L。 通过加入2 M HCland将溶液的pH值调节至7.0plusmn;0.2，使用水浴将温度保持在35plusmn;1°C。 图1显示了连续实验的示意图。

2.3. 分析方法

使用带有IonPac AS18阴离子柱的阴离子交换色谱法（ICS-1100，DIONEX，AR，美国）测定亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。 在检测之前，必须用0.22 lm孔径的滤膜过滤所有样品。用数字PH计测量PH值。

2.4. 荧光原位杂交分析

在第0天和第200天从反应堆R1，R2提取了用于荧光原位杂交（FISH）分析的厌氧生物质样品。FISH分析是根据Duan等人的方法进行的。在反应器中使用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的Amx820探针（5_AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3_）和4_，6-二ind基-2-苯基吲哚（DAPI）进行FISH分析，以观察厌氧菌细菌数量的变化。探针购自TaKaRa生物技术有限公司（日本）。将污泥样品在4°C的4％低聚甲醛甲醛缓冲液中固定24小时。将固定的细胞（约5mu;L）点在涂明胶的载玻片上，并在无菌的室温空间中干燥。在46°C的条件下杂交2小时。杂交后，通过用除探针以外的成分与杂交缓冲液相同的洗涤缓冲液冲洗，除去未结合的寡核苷酸。然后，将样品另外用DAPI染色以检测细菌总数。用奥林巴斯倒置显微镜（Olympus ZX71，日本），然后使用数码相机（日本尼康公司尼康D7000）捕获幻灯片的数字图像.Image Pro-Plus软件用于FISH分析。

2.5. 生物质提取物的制备和酶活性的测定

首先，从每个反应器中取出厌氧氨氧化生物质样品将其在4℃以8,000rpm离心20分钟。 其次，2 g电池除去上清液后称重（湿重），通过用磷酸钠缓冲溶液洗涤两次降低（20 mM，pH 7.0）。 之后，将洗涤过的颗粒重悬在20毫升相同的缓冲液中，然后冷冻和融化后裂解，超声处理（225 W，在4°C下持续30分钟）。最后，通过在4°C下离心30分钟（22,000 rpm）分离细胞碎片。将上清液保存在4°C，用作细胞提取物，用于测定蛋白质和酶的活性。 使用Bradford程序。以牛血清白蛋白（BSA）为标准测量蛋白质浓度。 肼脱氢酶活性（HDH）是根据Shimamura等人所述方法测定的。 用分光光度计描述为标准混合物中细胞色素c在550 nm处的吸光度增加（V-560 UV / VIS分光光度计，日本Jasco）。

2.6. 定量PCR（qPCR）分析

厌氧菌的实时PCR定量使用Amx 809-F和Amx 1066-R作为引物对。反应体积为25 lL，其中包含12.5 lLSYBROgrave;Premix Ex Taqtrade;（TaKaRa，大连，中国），0.4 mg / mL BSA，0.5 lL Rox参考染料，每种引物的最终浓度为200 nM，以及2 lL提取的DNA作为模板。每个样品分析三个重复样品。 PCR程序如下：在95°C下变性2分钟，然后在95°C下进行5 s的40个循环，在62°C下退火30 s，在72°C下延伸30 s。通过熔解曲线分析仅显示在Tm ＝ 87.0℃的一个峰。没有观察到与引物二聚体假象相关的可检测峰，也未观察到其他非特异性PCR扩增产物。在NanodropOgrave;ND-1000紫外可见分光光度计（NanoDrop Technologies，美国）上测定质粒DNA的浓度。然后从提取的质粒DNA浓度中直接计算出厌氧细菌的16S rRNA基因拷贝数。将已知拷贝数的质粒DNA的六倍系列稀释液一式三份用于q-PCR分析，以生成曲线。

3 结论与讨论

3.1启动期

反应器达到58 mg / L。 Bi等。 将这一时期称为细胞裂解（有效铵浓度gt;浓度一）。 同时，由于异养反硝化细菌的生长比自养厌氧厌氧细菌快得多，因此在第一阶段反硝化细菌可能占主导地位，从而导致该阶段大量亚硝酸盐的去除。 如表1所示，R1的细胞裂解阶段持续20天。 但是，仅在第16天，R2中氨水的浓度随溶液中RGO的添加而降低，低于其，并逐渐完成了微生物的分解。 此外，由于有机物的持续消耗，两个反应器中亚硝酸盐的去除均呈下降趋势，因为反硝化细菌活性降低。其次，检测到了一些有效的氨浓度波动，但平均值低于有效铵浓度。 该阶段类似于Bi等人的滞后阶段。 报告[19]。 如图2所示，氨和亚硝酸盐同时被去除时，出现了厌氧氨氧化活性。对于R1（对照）和R1，该阶段分别持续了17天（20-36天）和10天（16-25天）。 R2（添加RGO），在第35天，此阶段两个反应器的平均铵去除率经计算为14.7和82.8 gN /（m3 d）。 R1和R2的出水硝酸盐分别达到5.99和9.38 mg / L，在两个反应器中均显示出少年厌氧氨氧化活性（图2C）。

最后，铵盐和亚硝酸盐的去除率均迅速增加，硝酸盐按比例累积。以R2为例，从第26天到第49天，铵的去除率从33.5上升到165 g-N /（m3 d），而亚硝酸盐去除率从62.4达到223 g-N /（m3 d）。培养49天后，R2的铵盐和亚硝酸盐浓度均稳定低于10 mg / L。从第49天到第70天，硝酸盐的产量达到8.99–13.6 mg / L，计算得出的硝酸盐产量与铵盐消耗的化学计量摩尔比为0.22–0.28。这些标记表示活动提纯阶段由Bi等完成。 [19]。该比例和脱氮性能表明，R2中添加RGO的厌氧氨氧化工艺已成功启动。但是，直到18天后，相同的现象才出现在R1中。在第67天，无需添加RGO的厌氧氨氧化反应器的启动过程。 R1和R2的活动度升高阶段持续了第24天（第37-67天）和31天（第26-49天）。明显，RGO的加入加速了厌氧氨氧化反应器从常规活性污泥。厌氧氨氧化菌的启动期添加RGO可以将流程从67天缩短到49天，与对照组相比下降了26.9％。

A B

C D

3.2.运作稳定性

然后，在厌氧氨氧化反应器成功启动后，两个反应器运行平稳，以研究在氮负荷率（NLR）相同的情况下的运行稳定性。如图3所示，该研究分为两个阶段，包括氮浓度增加和HRT缩短。从第70天到165天，铵和亚硝酸盐浓度从50 mg / L逐步增加，并维持HRT。在6 h时，两个反应器的总NLR均在460至920 gN /（m3 d）之间。在第165天，R2加RGO的氮去除率（NRR）计算为715 g-N /（m3 d），而R1的NRR仅576 g-N /（m3 d）。之后，HRT从6小时缩短到3.7小时，以从165-229天开始增加两个反应堆的NLR。经过其他65天的培养后，两个反应堆的NLR均增加至1.52times;10 3 g-N /（m3 d）。两个反应堆的NRR分别为846和1.08times;10 3 g-N /（m3 d）。两个反应器的NRR比较，R2和RGO的添加比对照高27.4％。此外，在NLR增加的两个阶段中，R2的氨水和亚硝酸盐浓度均稳定地低于20 mg / L，而在相同条件下R1的氨水和亚硝酸盐浓度分别约为40和50 mg / L。这种现象可以归因于较高的厌氧氨氧化细菌活性和对高NLR的较强稳定性。实际上，我们的初步实验结果[12]表明，加入RGO可以提高厌氧氨氧化活性。新启动的厌氧氨气反应器的操作稳定性调查与我们之前的研究相吻合。

3.3. 酶活性的变化

图4描绘了运行期间两个厌氧氨氧化反应器的HDH活性变化。在将活性污泥加入厌氧氨氧化反应器之前，种子污泥的HDH活性仅为0.11 lM细胞色素c /（mg蛋白质·分钟）。在长期孵育期间，两个反应器的酶活均呈稳定增长趋势。在第200天，R1和R2的HDH活性分别达到0.89和1.16 lM细胞色素c /（mg蛋白质·分钟），分别比种子污泥高8.1倍和10.5倍。显然，添加RGO的R2样品始终表现出相对较高的HDH活性，这与脱氮性能密切相关。与R1相比，R2的HDH活性在200天时提高了42.1％。基于以上结果，RGO的添加大大提高了厌氧氨氧化生物质的HDH酶活性。 HDH活性的增加可能与RGO的出色电子转移能力紧密相关（稍后讨论）。

3.4. 细胞数量的变化

3.4.1. qPCR结果

qPCR结果可以反映出厌氧菌细胞相对于总细菌的数量，并且间接反映了两个反应器中厌氧菌

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